热毒宁注射液治疗新型冠状病毒肺炎的活性成分与潜在作用机制初探

陈元堃，曾奥，罗振辉，何树苗，李春梅，卢群

(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具传染性强、传播迅速、各类人群均易感等特点，其传播的途径主要包括了飞沫、接触、粪口等[1]。轻度感染患者表现为发热、干咳及乏力等症状，而重度患者可出现严重的急性呼吸衰竭、脓毒症、肾衰甚至死亡等[2-3]。到目前为止仍无治疗COVID-19的特效方法，主要采用中西医临床对症治疗的方式来应对[4-5]。

在疫情防治中中医的整体观及辨证论治特点优势十分显著，在国家健康委办公厅印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第6版)》中，就包含了热毒宁注射液[6]。热毒宁注射液主要由栀子、金银花、青蒿等三味中药组成，多应用在外感风热所引起的上呼吸道感染、咳嗽、微恶风寒、感冒等[7]，对多种病毒具有抑制作用，如肺内鼠巨细胞病毒、CVA16、甲型HIN1等[8]；相关机构药效筛选后初步发现热毒宁、金振口服液等中成药在体外具有抑制SARS-CoV-2的作用。本研究利用网络药理学的方法筛选出热毒宁注射液中的核心成分，并通过分析软件进一步探讨其与受体的分子对接结果和信号通路等，从而对治疗COVID-19的作用机制进行预测，为传统中医药治疗COVID-19提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 热毒宁中主要中药成分的获取及筛选

通过中药系统药理学数据库及在线分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php,TCMSP)收集青蒿、金银花、栀子的主要活性成分。口服生物利用度(OB)为药物的吸收、分布、代谢及排泄中的重要药代学参数之一，主要指口服药物中的有效成分和活性基等进入人体循环并被吸收的速度及程度，而OB值越高则代表此药物的生物活性、类药性(DL)越佳[9-10]。故本文以OB≥30%、DL≥0.18作为筛选条件来筛选出候选的活性成分。

1.2 预测COVID-19相关靶点

将“novel coronavirus pneumonia”作为检索关键词，选择“Homo sapiens”物种，通过GeneCards数据库获得与COVID-19相关的基因。

1.3 潜在靶点的预测及筛选重合靶点

通过TCMSP平台检索获得青蒿、金银花、栀子的靶蛋白，并利用Perl脚本筛选出候选活性成分的靶蛋白，剔除没有对应活性成分的靶蛋白，并将靶蛋白标准化建立数据集。通过R语言将上文获得的COVID-19相关的靶点与药物候选靶点取交集用于以下的分析。将获得的交集部分以及中药、候选活性成分整合为“network”、“node”文件，将其导入Cytoscape_v3.7.2中构建药物-活性成分-交集靶点的网络图。

1.4 蛋白互作网络的构建与分析

对获得的疾病与药物的共同靶点导入STRING进行分析，物种选择“Homo sapiens”，将置信度>0.7作为筛选指标。将获得的结果导入Cytoscape_v3.7.2进行蛋白-蛋白(PPI)互作模型的建立，并使用其中的分析工具(Network analyzer)及插件(MCODE)分析PPI网络。

1.5 KEGG和GO富集分析

利用DAVID平台进行GO及KEGG的富集分析，分析靶点涉及的基因功能及相应的信号通路，以P<0.05为筛选指标，并利用R语言将其可视化。

1.6 分子对接

从PDB数据库中下载目标蛋白的PDB文件，并用Discovery Studio 4.5 Client对目标蛋白进行删除水、加氢、确定对接位点等操作。利用ChemBio Draw Ultra 14.0、ChemBio3D Ultra 14.0画出关键化合物的化学结构，并将其转化为pbdqt格式。利用vina完成受体与配体的对接[11]，结合能若小于0表明受体与配体能够自发的结合，当前筛选活性靶点还没有统一的标准，故依据文献报道本文将结合能≤5作为筛选热毒宁注射液治疗COVID-19的活性成分[12-13]。

2 结果

2.1 收集、筛选热毒宁注射液活性成分及COVID-19潜在靶点

通过TCMSP数据库检索收集到青蒿126个成分，栀子98个成分，金银花236个成分。对得到的各中药中化学成分依据OB≥30%、DL≥0.18进行筛选，并剔除没有靶蛋白的化学成分，共得到50个有效的化学成分。在这些活性成分中，有的同时存在于3种中药中，如β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、槲皮素(quercetin)等(见图1)。同时，通过Genecards收集到COVID-19相关靶点共251个。

图1热毒宁注射液中药物-活性成分网络图

Figure1Drug-active ingredient network of Reduning injection

2.2 热毒宁注射液治疗COVID-19的潜在靶点

利用TCMSP数据库收集得到金银花、青蒿、栀子中50个化学成分的对应靶点共231个。在药物对靶点中，存在多个药物共同拥有多个靶点的情况；以及在药物活性成分对应的靶点中，存在一个活性成分对应多个靶点及多个活性成分对应一个靶点的情况。利用Perl脚本取热毒宁注射液中活性成分对应靶点与COVID-19相关靶点的交集之后，共得到43个热毒宁治疗COVID-19的潜在靶点。

2.3 构建及分析药物-活性成分-靶点网络

利用Cytoscape_v3.7.2构建“药物-活性成分-作用靶点”网络，见图2。网络中有70个节点及161条边，节点为活性成分及治疗靶点基因，边为它们之间相互作用的关系。从图2中可以发现一个活性成分对多个靶点起作用，且还存在多个活性成分对一个靶点有作用，这就体现了热毒宁注射液多成分、多靶点相互协同治疗COVID-19的特点。

2.4 蛋白互作网络的构建与分析

通过STRING构建的蛋白质之间的相互作用关系网络见图3。此网络图中有43个节点与459条边，图中节点越大表明其度值越大，边越粗表明其评分越高及关系越密切，颜色的深浅与度值及介值呈正相关的关系。在PPI网络图拓扑属性分析后得出，IL-6、CASP3等度值大于平均节点度值，确定为这一网络的核心靶点，之后利用MCODE分析得到2个具有显著性的子模块。模块1评分为20.000，包括22个节点与210条边，以上提到的核心靶点都包含在内；模块2评分为4.333，包括7个节点与13条边。见图3。

注：绿色-金银花; 紫色-青蒿;黄色-栀子; 多药物-红色; 蓝色-基因。

图2热毒宁注射液药物-活性成分-靶点网络

Figure2Drug-active ingredient-target network of Reduning injection

2.5 GO富集分析

GO富集分析后共得到125个富集的结果。其中生物过程(BP)有95个，主要涉及有RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控(positive regulation of transcription from rna polymerase ii promoter)、免疫反应(immune response)、炎症反应(inflammtory response)等方面。细胞成分(CC)有12个，主要涉及有细胞核(nucleus)、胞液(cytosol)等。分子功能(MF)有15个，主要涉及到蛋白质同源二聚化活性(protein homodimerization activity)、细胞因子活性(cytokine activity)等。本文选出BP、CC、MF的前10项富集结果做图4。

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析后，得到104条富集结果，包括信号转导通路(TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、HIF-1 signaling pathway)、毒感染相关通路(Influenza A、HTLV-I infection、Herpes simplex infection)、肿瘤相关通路(Pancreatic cancer、Small cell lung cancer)等，说明热毒宁注射液可能通过以上通路对COVID-19有作用。本文选出KEGG的前10项富集结果作图5。

2.7 分子对接

目前，多数研究认为配体与受体在结合构象稳定的情况下能量越低就表明此受体与配体发生作用的可能越大。通过对接后发现，芹菜素、木犀草素与SARS-CoV-23CL水解酶结合的能量最低，分别为-32.21 7kJ/mol、-30.962 kJ/mol。此次研究中的主要成分与SARS-CoV-23CL水解酶的结合能都远远小于-5 kJ/mol，与目前报道中具有抗COVID-19作用的化学药物瑞德西韦、利托那韦等相似，具体见表1。以上结果表明热毒宁注射液中的主要成分与SARS-CoV-23CL水解酶的结合形成的构象能量极低、结构较稳定、活性高，具体对接情况见图6。

模块1模块2

图3蛋白互作网络
Figure3Protein interaction network

图4GO富集结果
Figure4GO enrichment results

图5KEGG富集结果
Figure5KEGG enrichment results

3 讨论

本研究筛选出热毒宁注射液中符合标准的成分有50个，对应的靶点有231个，与COVID-19重合的有43个，表明了热毒宁注射液通过多成分、多靶点的方式来防治COVID-19。

从药物-活性成分-靶点网络中发现，涉及靶点最多的化合物均属于黄酮类化合物，主要为芹菜素(Apigenin)、槲皮素(Quercetin)、木犀草素(Luteolin)，且这3种化合物度值均较大，表明其可能为发挥防治作用的主要化合物。多项研究指出，

表1 热毒宁注射液关键成分与抗COVID-19化学药物与SARS-CoV-23CL水解酶的结合能
Table1Binding energy of key components in Reduning injection and anti-COVID-19 chemical drug with SARS-CoV-23CL hydrolase

NO化合物化学式相对分子质量CASSARS-CoV-2结合能/(kJ·mol-1)1芹菜素C15H10O5270.24520-36-53CL水解酶-32.2172木犀草素C15H10O6286.24491-70-33CL水解酶-30.9623槲皮素C15H14O9338.276151-25-33CL水解酶-30.5434山奈酚C15H10O6286.24520-18-33CL水解酶-30.5435异鼠李素C16H12O7316.26480-19-33CL水解酶-30.5436马钱苷酸C16H24O10376.3622255-40-93CL水解酶-29.7067豆甾醇C29H48O412.6983-48-73CL水解酶-28.900 8β-谷甾醇C29H50O414.7183-46-53CL水解酶-27.2169瑞德西韦C27H35N6O8P602.581809249-37-33CL水解酶-32.63510利托那韦C37H48N6O5S2720.96155213-67-53CL水解酶-31.79811洛匹那韦C37H48N4O5628.8192725-17-03CL水解酶-30.96212硝唑尼特C12H9N3O5S307.2855981-09-43CL水解酶-27.19613利巴韦林C8H12N4O5244.236791-04-53CL水解酶-25.10414氯喹C18H26ClN3319.87198513CL水解酶-24.267

图6SARS-CoV-23CL以及ACE2与芹菜素和木犀草素分子对接情况
Figure6SARS-CoV-23CL hydrolase and ACE2 docking with Apigenin and Luteolin

黄酮类化合物对柯萨奇病毒、流感病毒及乙肝病毒在内的多种病毒具有较强的抵抗作用[14]。芹菜素是一种潜力极大的天然化合物，其具有抗炎、抗癌、抗菌及抗病毒等多种功效[15]，对口蹄疫病毒有较强的抑制作用，且可阻碍病毒的翻译活动[16]。木犀草素因结构中含5-OH等，故表现出优越的抗病毒效果，如其对HIV-1中的蛋白酶及整合酶有较强的抑制作用，还具有抗肿瘤、抗炎镇痛、抗菌、调节免疫系统的作用[17]。此外，槲皮素是一种明星化合物，近几年来对其研究较多[18]。槲皮素可通过阻碍病毒受体复合物进入机体细胞内，阻断病毒的生活周期，最后导致其死亡[19]。LEE等[20]指出，槲皮素可通过抑制TLR-3的表达来影响炎症转录因子，从而起到抗HSV-1的效果。综上所述，热毒宁注射液中主要化合物均具较强的抑制病毒作用，进一步证明了热毒注射液的抗病毒功效。

在PPI网络图中，度值大于节点平均度值的靶点有IL-6、CASP3、MAPK8、MAPK1等。IL-6为机体内参与信息传递及调节激活免疫细胞的一种细胞因子，IL-6的表达失调会导致多种疾病的发生[21]。程林等[22]发现，在HIV患者体内sPD-1的过表达可能与HIV-1诱导IL-6分泌有关，从而使患者免疫系统清除HIV-1这一活动受到阻碍。昌仲勇等[23]发现联合血清IL-6、hs-CRP、PCT检查对COVID-19患者的预后及死亡风险具有很好的判断作用。CASP3为多条凋亡途径下游的共同效应成分，在多种细胞的凋亡中处于核心地位，被认为是执行死亡的蛋白酶。药物可通过影响CASP3从而起到抗病毒、抗肿瘤等作用[24]。刘晓婷等[25]发现黄芩苷可通过影响CASP3与CASP8的表达来改善流感病毒诱导细胞凋亡的情况。MAPK8、MAPK1均属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族里的成员，其可在多种环境应激中被激活，如DNA损伤、氧化应激、病毒感染、癌症等[26]。MIZUTANI等[27]发现在SARS-CoV感染的细胞中P38MAPK、MAPKAPK-2、HSP-27、CREB、eIF4E的下游靶点均可被磷酸化，同时在其他冠状病毒的感染中MAPK家族成员也可被激活。

GO与KEGG的富集结果主要涉及细菌感染、病毒感染、肿瘤等方面，说明热毒宁注射液中的多种活性组分可能通过对COVID-19中失衡的通路进行协同调控，从而起到防治的作用。陈跃宣等[28]利用热毒宁联合阿奇霉素治疗支原体肺炎的患者时发现，两者联合治疗时疗效好且可使患者血清中的促炎因子、抗炎因子及细胞的免疫指标得到改善。赵志勇等[29]得出用热毒宁与大剂量的丙种球蛋白来联合治疗患儿的急性重症病毒性肺炎的疗效好、安全性高、预后佳，且较以往的病程大大缩短。本研究得出结果进一步证实了热毒宁注射液在肺部疾病中的疗效。

从分子对接的结果可知，芹菜素、木犀草素、槲皮素、山奈酚等与目前临床上推荐的对COVID-19有效的化学药物的结合能相近。有研究提出，SARS-CoV-2及SARS-CoV表达的S蛋白与机体中的血管紧张素转化酶(ACE2)结合后可使病毒入侵，从而进一步导致疾病的发生。因此，本研究将热毒宁注射液中的主要成分(芹菜素、木犀草素)与ACE2来进行分子对接。对接后发现芹菜素、木犀草素与ACE2的结合能均小于-5，分别为24.267 kJ/mol、23.849 kJ/mol。

综上所述，研究中结合网络药理学与分子对接的方法对热毒宁注射液抗COVID-19的化学成分、靶点、作用机制以及主要成分与SARS-CoV-2水解酶和ACE2的结合能作出了初步的预测，为日后的抗新型肺炎药物的研发提供了一个思路。但本研究还存在有一定的局限性，如数据库不完整、忽略了中药中成分的含量、在机体内其他药代动力学的作用等。对于以上存在的这些问题，后期可通过进行药效和临床治疗效果的探究，更深入地验证，为新药物的研发提供新思路及方向。