加味芪黄饮激活InsR-IRS-1-PI3K-GLUT4信号通路延缓糖尿病肾病的研究

赵威，蒙向欣，李娟，李辉远

(广州医科大学附属中医医院肾病科，广东 广州 510130)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病严重的微血管并发症，是导致终末期肾脏病的常见原因之一，严重危害患者的生命健康[1]。研究表明，胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是糖尿病患者的重要临床特征，同时也是DN发生发展的独立危险因素[2]。胰岛素受体(insulin receptor,InsR)、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、葡萄糖转运体4(glucose transporter 4,GLUT4)是胰岛素信号转导通路的重要组分，其组成的InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路与IR密切相关[3]。前期研究表明，具有“益气养肾、化瘀清利”功效的自拟方——加味芪黄饮在治疗DN中疗效确切[4-6]，但其具体机制目前尚未阐明。本文拟通过观察加味芪黄饮对DN大鼠的治疗作用，研究其对IR状态和InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路的影响，以期为加味芪黄饮治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠，40只，SPF级，体质量250～300 g，购自南方医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2016-0041。

1.1.2 试剂与仪器 加味芪黄饮由广州医科大学附属中医医院中药制剂室提供；链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)(美国Sigma公司)；碘(125I)胰岛素放射免疫分析药盒(北京科美东雅公司)；兔抗鼠InsR多克隆抗体、兔抗鼠IRS-1多克隆抗体、兔抗鼠PI3K多克隆抗体、兔抗鼠GLUT4多克隆抗体(英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔IgG(美国CST公司)；RM2135型石蜡切片机(德国LEICA公司)；IX71型普通荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)肾病大鼠模型[7]大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组(n=10)和DN组(n=30)。正常组：大鼠全程予普通饲料喂养。DN组：大鼠全程予高糖高脂饮食(66.5%常规饲料+20%蔗糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐)，喂养8周后，禁食24 h，空腹状态下以1% STZ按45 mg/kg一次性腹腔注射，正常组大鼠予等量枸橼酸钾缓冲液处理。1周后，尾静脉取血测定大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平，当FBG>13.9 mmol/L时，表明T2DM模型建立成功(共30只)。STZ注射后2周，代谢笼收集两组大鼠24 h尿液，检测24 h尿白蛋白(24-hour urinary albumin,24 h UAlb)水平，当24 h UAlb>正常组均值3倍时，表明T2DM肾病模型制备成功[8]。

1.2.2 分组及给药方法 将T2DM肾病大鼠随机分为正常组、模型组、加味芪黄饮低、高剂量组(以下简称低剂量组、高剂量组)，每组各10只。低、高剂量组大鼠每日分别予加味芪黄饮400 mg/kg、800 mg/kg灌胃治疗，正常组、模型组大鼠则分别予等量生理盐水处理，总疗程共12周。

1.2.3 血、尿生化指标检测 12周后检杀大鼠，代谢笼收集24 h尿液行24 h UAlb定量；尾静脉取血，全自动生化分析仪检测各大鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、FBG等指标，放射免疫法检测大鼠空腹胰岛素(fasting insulin,FIns)水平，并计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR),HOMA-IR=FIns×FBG/22.5。

1.2.4 肾组织HE染色检查及MEI评分 留取大鼠肾组织标本，以4%(φ)多聚甲醛固定、石蜡包埋后，制成厚度2 μm组织切片并行HE染色，光镜下观察肾组织病理变化。按文献[9]描述的方法，半定量肾小球系膜增生指数(mesangial expansion index,MEI)：200倍光镜下，每张切片随机选择15个肾小球，每个肾小球按系膜增生程度分为0～3分(0：正常肾小球；1：肾小球基质增生达0～50%；2：肾小球基质增生达50%～75%；3：肾小球基质增生达75%～100%)，取其均值作为每组大鼠的MEI评分。

1.2.5 免疫组化检测肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达 取2 μm肾组织切片常规脱蜡、水化，3% H2O2室温孵育5 min；将切片浸泡于0.01 mol/L枸橼酸钠溶液(pH 6.0)中，高温(95 ℃，10 min)抗原修复；10%(φ) BSA室温封闭10 min，分别滴加兔抗鼠InsR一抗(1∶100)、IRS-1一抗(1∶100)、PI3K一抗(1∶100)和GLUT4一抗(1∶100)，湿盒内4 ℃冰箱孵育过夜；继而分别滴加HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，湿盒内室温孵育60 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。按文献[10]描述的方法，每例切片在200倍光镜下随机选取10个不连续视野，利用高清晰度彩色医学图文分析系统，测定肾组织中上述相关蛋白吸光度值。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、 HOMA-IR测定

与正常组比较，模型组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR水平均明显升高(P<0.01)；与模型组比较，加味芪黄饮低、高剂量组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN、FBG、FIns、HOMA-IR均降低(P<0.05)，且随剂量增大，其下降趋势更为显著(P<0.05)(表1、表2)。

2.2 各组大鼠肾组织病理变化及MEI评分

HE染色观察肾组织病理变化，正常组大鼠：肾小球结构正常，肾小球基底膜、系膜细胞、系膜基质未见明显增生，肾小管形态正常。模型组大鼠：肾小球肥大，肾小囊腔狭窄呈裂隙状，肾小球基底膜、系膜细胞、系膜基质弥漫性增生，肾小管上皮细胞可见空泡和颗粒变性。低剂量组、高剂量组大鼠：肾小球和肾小管病理损伤程度均较模型组减轻，且随药物剂量增加，减轻程度更显著(图1)。半定量各组大鼠MEI评分，结果见图2。

2.3 各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达

与正常组比较，模型组大鼠上述相关蛋白表达均下调(P<0.05)；与模型组比较，加味芪黄饮低、高剂量组上述蛋白表达升高(P<0.05)，且随剂量增大，各蛋白升高程度更趋明显(P<0.05)(图3，表3)。

表1 各组大鼠24 h UAlb、Scr、BUN测定Table 1 Levels of 24 h UAlb,Scr and BUN of rats in each

与正常组比较:*P<0.01； 与模型组比较:#P<0.05； 与低剂量组比较：△P<0.05。

表2 各组大鼠FBG、FIns、HOMA-IR测定Table 2 Levels of FBG,FIns and HOMA-IR of rats in each

与正常组比较:*P<0.01； 与模型组比较:#P<0.05； 与低剂量组比较：△P<0.05。

注：图A、B、C、D：200×； 图 E、F、G、H：400×

图1各组大鼠肾组织病理改变(HE染色)
Figure1Pathologic morphology in renal tissue of rats in each group (HE staining)

正常组模型组低剂量组高剂量组3.53.02.52.01.51.00.50.0MEI*##△

与正常组比较：*P<0.01； 与模型组比较:#P<0.05；与低剂量组比较：△P<0.05。

图2各组大鼠肾小球MEI评分

3 讨论

随着生活水平的提高和饮食结构的改变，DN在人群中的发病率日益增高，不仅严重危害人类身体健康，也给社会带来沉重的经济负担[11]。DN属于祖国医学“消渴”“水肿”“尿浊”“虚劳”等病范畴，其多为本虚标实之证，本虚责之肝、脾、肾虚，标实则多为痰湿、湿浊、淤血，故其治疗当以补益肝脾肾为本，固其封藏，正其开阖，兼以祛痰除湿，活血化瘀。加味芪黄饮是本研究小组根据祖国医学治疗消渴虚劳之名方——六味地黄丸化裁而来，方中以黄芪为君，取其补气健脾，利水祛湿，摄血藏精之效；辅以太子参补中益气，生津复血；生地黄滋补肾阴，兼清虚热；山茱萸滋补肝肾，涩精固脱；山药、茯苓健脾补虚，泽泻利湿泄浊，丹皮、溪黄草清热解毒，女贞子、白茅根、蝉蜕止血，诸药相伍，共奏“益气养肾、化瘀清利”之功。本研究采用加味芪黄饮治疗DN大鼠，可降低大鼠24 h UAlb、Scr、BUN水平，改善肾组织病理损伤程度及MEI评分，这与前期的研究结果一致[4-6]，说明加味芪黄饮治疗DN疗效确切。

IR是糖尿病的重要病理表现，是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素的敏感性降低，机体需要过量的胰岛素才能发挥生物效应的一种状态[12]。HOMA-IR是评估IR状态的重要指标，实验结果显示，加味芪黄饮治疗DN大鼠，可降低大鼠FBG及FIns水平，从而降低HOMA-IR，改善DN大鼠的IR状态。IR在DN的发生发展中起重要作用，在DN大鼠模型中，IR可通过促进IL-1、IL-6等相关炎症因子表达，导致大鼠血肌酐、尿蛋白水平升高[13]。在DN小鼠模型中，IR可通过促进肾小球系膜细胞及系膜基质增生，加重肾组织病理损伤[14]。因此猜想：加味芪黄饮可能通过改善DN的IR状态，从而延缓DN的进展。

InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4是胰岛素信号传导的重要通路，其表达水平高低与IR状态呈负相关[15]。正常情况下，当胰岛素抵达靶细胞时，可先与靶细胞上的InsR结合并引起InsR磷酸化，磷酸化的InsR一方面为其他分子提供结合位点，另一方面可磷酸化其下游的IRS-1，磷酸化的IRS-1进一步激活其下游的PI3K，使信号以激酶链式反应下传，最终导致细胞内GLUT4合成、分泌、移位，GLUT4是直接影响葡萄糖进入细胞的因子，直接影响血糖的调节[16-17]。

图3各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4蛋白表达(DAB显色，200×)
Figure3Expression of InsR,IRS-1,PI3K and GLUT4 in renal tissue of rats in each group (200×)

表1 各组大鼠肾组织中InsR、IRS-1、PI3K、GLUT4吸光度值Table 1 Absorbance values of InsR,IRS-1,PI3K and GLUT4 in renal tissue of rats in each group

与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较:#P<0.05；与低剂量组比较：△P<0.05。

本研究结果显示，模型组与正常组大鼠相比，InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4通路中各蛋白表达水平均下调，使用加味芪黄饮治疗后，上述各蛋白表达水平升高，且该效应具有一定量效关系，提示加味芪黄饮可能通过激活InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路，进而改善IR状态。

综上所述，加味芪黄饮治疗DN疗效确切，其可能通过激活InsR/IRS-1/PI3K/GLUT4信号通路，改善IR状态，最终延缓DN进展。