左旋班布特罗吸入水雾剂的制备及处方优化

张睿，周浩銮，张雪娟，胡军华，王冠林，陈茜，谭文

(1．广东工业大学生物医药研究院，广东 广州 510006； 2．中山大学药学院，广东 广州 510006)

支气管哮喘是常见的呼吸疾病，具有气道高反应性、炎症、气流受限、喘息、气促、咳嗽等症状[1]。班布特罗(Bambuterol，BMB)是一种长效选择性β2受体激动剂，口服后在体内经血浆水解为特布他林而发挥支气管扩张作用，其半衰期较长(约13 h)[2]，药效持久(约24 h)，尤其适用于支气管哮喘的治疗[3-5]。班布特罗具有消旋体、右旋体(S型)及左旋体(R型)3种异构体。本课题组前期研究表明，左旋班布特罗(R-BMB)相对其他2种异构体，具有更强及更持久地气道舒张作用，同时可有效防止气道过敏性炎症的发生。班布特罗右旋体能增加豚鼠的气道反应，而消旋体及左旋体则无此现象[6-7]。

班布特罗目前临床给药途径通常为口服，具有生物利用度低、用药量大、副作用高、起效缓慢等缺点。肺部吸入制剂是将药物以气溶胶形式递送至肺部或呼吸道发挥局部或全身作用的制剂[8]，具有起效快、靶向、无首过效应等优势[9]。目前，肺部吸入制剂主要包括吸入粉雾剂、吸入气雾剂及吸入水雾剂3种常见的制剂形式[10]。相比其他2种吸入制剂，吸入水雾剂具有使用方便、喷雾量可调整及患者依从性好等优点。喷射型雾化装置相比较超声雾化及振动筛孔雾化装置具有雾化粒径均一等优势，已广泛使用于临床治疗[11]。

粒径大小及分布是吸入制剂关键指标，直接影响吸入药物在肺部的有效沉积率。2015年版《中国药典》规定粒径大小须控制在10 μm以内，大多数小于5 μm[12]。颗粒大于5 μm，沉积于上呼吸道及口咽部。粒径小于1 μm，则易随呼气呼出体外。此外，影响水雾剂粒径大小及分布因素很多，如温度、呼吸模式、湿度及表面张力等[11,13]。

基于吸入水雾剂及BMB左旋体的优势，本研究以甘油及丙二醇为辅料，以正交实验设计9个处方，测试各处方pH值、渗透压、表面张力及粒径大小及分布，并运用方差分析法分析粒径测试结果，进而探讨丙二醇及甘油对雾化粒径大小及分布的影响，筛选出肺部有效沉积率较优的处方，为R-BMB吸入水雾剂的开发提供参考。

1 试剂与仪器

R-BMB(东莞市凯法生物医药有限公司,批号：20180705，纯度≥99%)；1，2-丙二醇(天津市大茂化学试剂厂，批号：20171008，纯度≥99%)；甘油(天津市津东天正精细化学试剂厂，批号：20180601，纯度≥99%)；生理盐水(河南双鹤华利药业有限公司，批号：19081706F)；甲醇(美国Fisher，批号：178507，HPLC级)；乙腈(美国Fisher，批号：178497，HPLC级)；磷酸(成都市科龙化工试剂厂，批号：20130411，纯度≥85%)；NaH2PO3(美国Sigma，批号：SLBS6288，纯度≥99%)；庚烷磺酸钠(美国Fisher，批号：1730886，HPLC级)。

Model 5600露点渗透仪(美国WESCOR)；BZY-1全自动表面张力仪(上海平轩科学仪器有限公司)；Seven compact pH离子计(瑞士Mettle Rtoledo)；Waters e2695高效液相色谱；NGI药用粒子撞击器(美国Copley)；新帕泰克HELOS激光粒度仪(德国新帕泰克)；Pari®LC sprint喷射雾化器(德国百瑞)；Pari®BOY SX空气压缩泵(德国百瑞)。

2 方法

2.1 处方设计及制备方法

目前，市售BMB剂量为每天20 mg[14]，综合吸入制剂起效优势及吸入水雾剂雾化时损耗情况，本研究R-BMB剂量设为2.5 mg/mL，雾化2 min，总量为5 mg。CFDA批准的吸入辅料甘油及丙二醇的限度分别为7.30%和25.00%[15]。在限度范围内选取3个跨度值：甘油0%、1%及2%，丙二醇0%、8%和15%。以此选取正交试验因素和水平，见表1。正交试验处方设计见表2。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

取R-BMB 25 mg置于10 mL棕色容量瓶，按表2加入相应的甘油及丙二醇，用生理盐水定容，得到R-BMB溶液。BMB在水中溶解度为33 mg/mL，所有处方药物浓度为2.5 mg/mL，不同实验项目前重新配制溶液。

表2 正交试验处方设计Table 2 Prescription design of orthogonal test

2.2 HPLC法测定R-BMB的质量分数[16]

2.2.1R-BMB对照品溶液的制备 精密称取R-BMB原料药25 mg，放于10 mL棕色容量瓶中，用流动相定容，配制成2.5 mg/mL的工作液，将工作液逐级稀释，得到500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、1.953、0.488 μg/mL10个等梯度的对照品溶液。

2.2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：40 ℃；检测波长：220 nm；流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇-乙腈(体积比500∶309∶100，加入0.12%的庚烷磺酸钠)。R-BMB的HPLC色谱图见图1。可见，R-BMB保留时间为6.2 min，主峰分离良好，阴性溶液色谱图对主峰测试无影响。

0.250.200.150.100.050.00AU2.52.01.51.00.50.0?10-3AB02468100246810t/mint/min

A.R-BMB溶液； B.阴性溶液。

图1R-BMB及阴性溶液HPLC色谱图

Figure1HPLC chromatograms ofR-BMB and reference solution

2.3 理化性质测试

2.4 粒径测试

2.4.2 碰撞法测定粒径 根据2015年版《中国药典》吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法[12]，采用NGI进行空气动力学粒径测试，将NGI各收集盘的含量计算结果通过软件(CITDAS，copley_V310，美国Copley)分析，可得到9个处方雾化吸入溶液的质量中位直径(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和细颗粒百分比(fine particle fraction，FPF)参数。每个处方重复测试3次。

2.5 正交试验结果评价方法

肺部有效沉积率是吸入制剂的关键指标，而d0.5及MMAD直接决定肺部有效沉积率。正交试验中方差分析能精确估计各因素的影响程度，应用广泛。本研究选用方差分析法对试验结果中d0.5及MMAD进行分析，计算得出F值，筛选R-BMB吸入水雾剂中的丙二醇及甘油最优配比[20]。

3 结果

3.1 理化性质测定结果

9个处方的pH值、渗透压和表面张力测定结果见表3。

表3 9个处方的理化性质测定结果Table 3 Physical and chemical properties of nine prescriptions

从表3可见：在丙二醇等量的条件下，随着甘油的增加或减少，pH值没有明显变化，可知甘油对pH值的影响无统计学意义(P>0.05)；在甘油等量的条件下，随着丙二醇用量的增加，pH值有降低趋势，可知丙二醇对pH值的影响有统计学意义(P<0.01)；所有处方pH值均在3～8.5范围内，符合《中国药典》规定[12]。在丙二醇等量的条件下，随着甘油及丙二醇量的增加，渗透压值有升高趋势，可知甘油及丙二醇对渗透压的影响有统计学意义(P<0.01)。在丙二醇等量的条件下，随着甘油的增加或减少，表面张力值均没有明显变化，可知甘油对表面张力的影响无统计学意义(P>0.05)，在甘油等量的条件下，随着丙二醇用量的减少表面张力有升高趋势，可知丙二醇对表面张力的影响有统计学意义(P<0.05)。

3.2 粒径测试

3.2.1 激光衍射法测试粒径结果 从表4可见，R-BMB雾化吸入溶液9个处方的粒径分布皆符合吸入水雾剂的处方要求，其中处方F3、F4、F6、F7及F8测试结果d0.5在2.553 μm左右[11]，具有较好的肺部沉积率；且随着丙二醇用量的增加，d0.5有减小的趋势；当丙二醇为0%和8%时，随着甘油的增加d0.5同样有减小的趋势，而丙二醇为15%时，随着甘油的增加d0.5有增加的趋势。所有处方Span值均较小，表明此水雾剂粒径分布相对均一。

表4 9个处方的激光衍射法测定粒径结果Table 4 Determination of particle size by laser diffraction in nine prescriptions

3.2.2 碰撞法测定粒径结果 由从表5可见，所有处方的FPF值和MMAD值皆满足吸入水雾剂药物颗粒粒径要求[12]，表明其肺部有效沉积率较高。处方F3、F5及F8的MMAD小于4 μm，FPF在60%以上。当甘油的量为0%和2%时，随着丙二醇量的增加，MMAD有减小的趋势，而甘油的量为1%时，随着丙二醇量的增加，MMAD有增加的趋势。当丙二醇为0%和8%时，随着甘油量的增加，MMAD先减小后增加，而当丙二醇为15%时，随着甘油量的增加，MMAD先增加后减小。

从图2各处方药物在NGI各盘的质量分数测定结果可见，F3、F4、F6、F7及F8在Stage4～Stage6级段(其截留粒径1.36～3.30 μm)[11]药物沉积较多，表明随着甘油和丙二醇的加入，有助于药物的肺部递送及沉积，丙二醇的影响程度较大。

3.3 正交试验分析结果

采用L9(34)正交表，方差分析法分析d0.5及MMAD数值，结果见表6及表7。

表5 9个处方的FPF和MMAD测定结果Table 5 FPF and MMAD of nine prescriptions

4530150质量分数/%F1F2F3F4F5F6F7F8F9Stage1Stag2Stage3Stage4Stage5Stage6Stage7装置喉MOC

表7 d0.5及MMAD方差分析表Table 7 Variance analysis of d0.5 and MMAD

在1～5 μm范围内，d0.5及MMAD越小，沉积效率越高[11]。表6的d0.5方差分析结果表明最优处方为A3B3(F8)，即2%甘油和15%丙二醇；而MMAD方差分析结果表明最优处方为A2B3(F4)，即1%甘油和15%丙二醇。方差分析不仅可以看因素影响的主次，同时可以看出其影响是否显著，从2个指标分析结果的F值可见，丙二醇对试验的影响明显大于甘油，但没有达到显著程度。

将处方F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7及F9与处方F8(2%甘油和15%丙二醇)的d0.5及MMAD进行处方间单独显著性分析，结果见表8。可见，F8处方与其余处方的d0.5及MMAD的差异随着甘油及丙二醇的添加，有由极显著性到无显著性的趋势。

注：以P<0.05为差异具有统计学意义。

3.4 验证试验

为了验证上述方差分析得出辅料配比的可行性，以处方4(1%甘油和15%丙二醇)制备3批样品，并进行吸入水雾剂指标验证，结果见表9。可见，处方各项指标均符合《中国药典》要求。肺部有效递送效率是吸入制剂的关键指标。在d0.5和MMAD方面，由表6可知F4处方较其他处方有较低的数值，表明它有更高的肺部有效递送效率。

表9 验证试验结果Table 9 Verification of experimental results

4 讨论

本文结果显示，甘油对pH值无显著影响，而丙二醇则有极显著影响，可能是由于甘油是三元醇，丙二醇是二元醇，在自身及促进溶液中离子电离程度不同，溶液中的离子主要是R-BMB离子、氢离子、氢氧根离子及甘油和丙二醇电离的离子，处方中丙二醇加入量跨度较大，可能引起了R-BMB、甘油、水及其本身的电离动态平衡，促进了氢离子的产生，从而降低了溶液的pH值。渗透压与溶液浓度有关，甘油与丙二醇的添加均会改变溶液浓度，所以二者对渗透压均有极显著影响。对于表面张力而言，甘油对其影响不显著，而丙二醇则有显著影响，可能是因为丙二醇是常见的表面活性剂，也可能跟甘油和丙二醇添加量有关。

综合pH、渗透压、表面张力与d0.5及MMAD结果，总体上随着甘油和丙二醇的增加，d0.5与MMAD有下降趋势，从而使得药物有较好的肺部沉积率。激光衍射法测试粒径结果，当丙二醇的量为不同值时，随着甘油的增加d0.5有减小或者增加的趋势。碰撞法测试粒径结果，当甘油的量为不同值时，随着丙二醇量的增加，MMAD有减小或增加的趋势。当丙二醇的量为不同值时，随着甘油量的增加，MMAD先减小后增加或者先增加后减小。此现象说明不同原理的粒径测试方法之间存在一定的差异性，同时溶液性质能显著影响吸入水雾剂的粒径大小，从而影响其肺部有效沉积率。此结果与McCallion等[13]研究结果类似。从本研究结果来看，甘油及丙二醇加入量的不同能使pH、渗透压及表面张力发生改变，从而影响吸入水雾剂的粒径大小及分布，最终影响肺部有效沉积率。但溶液体系复杂，理化性质众多，这也是粒径大小没有和甘油及丙二醇加入的量成线性的原因。除pH、渗透压及表面张力3种理化性质以外的其他因素也需要考虑，本团队后续将进一步研究。

粒径大小及分布影响因素较多，除药物溶液本身理化性质以外，雾化环境[11]等也是重要影响因素。本研究正交实验方差分析结果表明，处方A3B3(2%甘油和15%丙二醇)和A2B3(1%甘油和15%丙二醇)为较优处方，由于碰撞法为吸入制剂粒径测试的“金标法”[11]，且根据辅料最低用量原则，推荐处方4(1%甘油和15%丙二醇)为R-BMB吸入水雾剂处方。从表7方差分析结果可见，甘油及丙二醇均无表现出显著影响，但表8处方间单独显著性分析结果显示随着甘油及丙二醇的加入，影响呈显著性上升趋势，其中丙二醇更为明显。这可能与辅料选用的添加量较少有关，此外，甘油和丙二醇之间的相互干扰也可能引发这种差异。

吸入水雾剂雾化器主要有喷射雾化器、超声雾化器及振动筛孔雾化器3种类型，而喷射型雾化器较其他2种具有使用简便、雾化出的气溶胶粒径大小均一稳定、肺部有效沉积率高等优点，被广泛应用于医院和家庭[11]。因此，本研究中使用的雾化器为喷射型雾化器，但吸入制剂的雾化粒径大小除与处方工艺有关之外，还在很大程度上取决于雾化装置，本研究局限于喷射型雾化器，后续研究需增加对不同类型装置影响的考察。