伤科药水的体外抗菌活性研究

安宁，黄瑾妍，江炜，许昕怡，邓雅方，杨育昆，陈艳芬

(广东药科大学中药学院，广东 广州 510006)

皮肤软组织感染包括急性皮肤软组织感染(如疖、脓肿、急性蜂窝组织炎等)和慢性难愈合创面(如慢性溃疡、烧烫伤、褥疮等)继发感染。目前皮肤感染主要依靠抗菌药物治疗或通过外科手术及时清创引流后再辅助于一定的抗菌药物治疗。因此，抗菌药物在皮肤感染治疗过程中的作用不容置疑，但其毒副作用如过敏反应、二重感染及日益严重的细菌耐药性问题等使其应用受到一定限制[1-3]。近年来有较多文献报道中药抗菌的优势[4-5]，中药抗菌研究不断被重视，因此开发中药资源对抗细菌感染十分重要。伤科药水是一种基于传统中医药理论和临床经验创制的医院制剂，由黄连、栀子、紫草等中药组成。其具有抗炎消肿、清热凉血、活血化瘀等作用，临床主要用于软组织及骨骼损伤、跌打损伤，在骨伤科应用广泛。前期研究证实其有良好的抗炎镇痛作用，且有一定的抗感染作用。本研究通过开展伤科药水体外抗菌作用的实验研究，明确其体外抗菌作用特点，为该制剂的临床应用和进一步研发奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 实验菌种

金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC 26003)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureusMRSA3-1007-W1)；粪肠球菌(EnterococcusfaecalisEFA-17001-W1)；链球菌(StreptococcusCMCC 32210)；白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)；铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa[CMCC(B)10 104])；大肠埃希菌(EscherichiacoliCMCC 44102)均由广东药科大学基础学院保存。

1.2 实验药物

伤科药水，由广东药科大学中药药理学系提供；黄连(批号20181101)，佛山市中天中药饮片有限公司产品；莫匹罗星软膏(国药准字H10930064)，中美天津史克制药有限公司。

1.3 实验试剂

营养肉汤培养基(批号：3105222)、营养琼脂培养基(批号：3105730)、LB琼脂培养基(批号：1074511)均为广东环凯微生物科技有限公司产品；血清(批号：42G9247K,life technologies)、氯化钠(批号20171204-2)，广州化学试剂厂。

1.4 实验仪器

SW-CJ-IF单人双面超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；JJ200型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；THZ-98A恒温振荡器，BWS-27G精密恒温水槽；LRH系列生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GI54TW全自动立式高压灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司；UV2310Ⅱ双束紫外可见分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；H1850R医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

2 方法

2.1 菌液的制备

将装有各实验菌的冻存管取出后用37 ℃水浴快速解冻后，吸取少量菌液加入100 mL营养肉汤中，置恒温振荡器中120 r/min、37 ℃的条件下培养24 h。用无菌生理盐水冲洗菌板，收集菌液，采用比浊法计算菌液浓度，用无菌生理盐水配制成浓度约为1×107CFU/mL菌液。

2.2 药物的制备

2.2.1 黄连水煎液 取黄连50 g，加蒸馏水400 mL，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎煮30 min，用纱布过滤后备用。药渣再加蒸馏水200 mL，二次煎煮30 min，过滤，合并2次滤液，浓缩至100 mL，得黄连水煎液500 mg/mL，置4 ℃备用。

2.2.2 莫匹罗星水溶液 取莫匹罗星软膏(含量20 mg/g)6 g，加入无菌蒸馏水至4 mL，溶解，得30 mg/mL的莫匹罗星溶液，置4 ℃备用。

2.3 打孔法测量抑菌圈试验

以33 g/L质量浓度配制营养琼脂，加入蒸馏水后，高压灭菌121 ℃ 30 min后得营养琼脂溶液，在每块培养皿中倒入25 mL营养琼脂溶液，自然冷却得营养琼脂平板。取配制好的细菌悬液(浓度为1×107CFU/mL)均匀涂布于琼脂培养基上，每块琼脂平板平均分成4份，在每个区域中心打完孔后用无菌针头挑出培养基。分别取伤科药水(690 mg/mL)、黄连水提液(500 mg/mL)、莫匹罗星水溶液(30 mg/mL)、无菌蒸馏水各50 μL，放入对应孔中。将培养皿置于37 ℃恒温箱中培养24 h，测量抑菌圈直径并记录。

2.4 琼脂稀释法测定最低抑菌浓度

通过前期预实验初步确定试验菌MIC在56～35 mg/mL，将灭菌后的伤科药水与培养基按一定比例混合，使得到的含药琼脂浓度分别为55.2 mg/mL、50.6 mg/mL、46 mg/mL、41.4 mg/mL、36.8 mg/mL。吸取5 μL的金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌菌液点种到含药的营养琼脂培养基中；吸取5 μL的大肠埃希菌菌液点种于LB培养基；吸取5 μL的链球菌菌液点种到含药的血清培养基中；另取不含药液的营养琼脂平板空白对照。将培养基置37 ℃培养箱中培养18 h后观察平板长菌情况，以含药物浓度最低平板有、无细菌生长的浓度为受试菌的抑菌浓度范围。重复试验，以药物最低浓度平板无细菌生长者即为受试菌的最低抑菌浓度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 抑菌试验

表1结果显示，伤科药水(690 mg/mL)对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌均有抗菌活性，其抑菌圈直径与无菌蒸馏水组相应的直径比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；但其抗菌效果低于黄连水煎液(500 mg/mL)，略强于莫匹罗星水溶液(30 mg/mL)。其中，伤科药水作用24 h后对金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的抑菌圈直径，与黄连水煎液、莫匹罗星水溶液各组的抑菌圈直径比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。抑菌圈试验结果见图1。

3.2 MIC测定结果

表2结果显示，伤科药水质量浓度为55.2 mg/mL时，所有供试菌均不能生长。其中，伤科药水对金黄色葡萄球菌的MIC为36.80 mg/mL、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC为35.27 mg/mL、粪肠球菌的MIC为50.60 mg/mL、链球菌的MIC为47.35 mg/mL、铜绿假单胞菌的MIC为46.00 mg/mL、大肠埃希菌的MIC为35.27 mg/mL、白色念珠菌的MIC为52.13 mg/mL。提示伤科药水对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的抑制作用较强。

D/mm

与无菌蒸馏水比较：aP<0.05； 与黄连水溶液比较：bP<0.05； 与莫匹罗星水溶液比较：cP<0.05； 与伤科药水比较：dP<0.05。

A.金黄色葡萄球菌； B.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌； C.粪肠球菌； D.链球菌； E.铜绿假单胞菌； F.大肠埃希菌； G.白色念珠菌； a.黄连水溶液； b.伤科药水； c.蒸馏水； d.莫匹罗星水溶液。

图1抑菌圈试验结果图
Figure1Graph of bacteriostatic circle results

表2 伤科药水对7种细菌的MICTable 2 MIC of Shangke Yaoshui against 7 kinds of bacteria

4 讨论

皮肤软组织感染是临床上常见的感染性疾病，治疗不当病情易反复或诱发全身症状。为了使研究更贴近临床，本实验所采用的病菌均为临床皮肤感染常见菌[6-8]，体外考察伤科药水抗皮肤软组织感染的机制。伤科药水是一种纯中药医院制剂，临床已证实具有一定的预防和治疗皮肤软组织感染作用，作为中药制剂不易产生细菌耐药性，在一定程度上弥补了抗菌药物的不足。该制剂中黄连清热燥湿、泻火解毒，栀子清热利湿、凉血解毒，紫草清热解毒、凉血活血，而且现代药理研究证实这些中药都有明显的抗菌作用[9-11]。

本研究发现伤科药水对所有受试菌都有较好的抑制作用，特别是在抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌作用上，效果明显强于30 mg/mL莫匹罗星水溶液(P<0.05)，说明伤科药水有较好的体外抗菌作用，对革兰阳、阴性菌及真菌都有一定抑制作用，这种作用可能是该复方制剂有效防治皮肤软组织感染的机制之一。金黄色葡萄球菌是引起皮肤软组织感染的主要病原菌[12-13]，本研究MIC实验中发现，金黄色葡萄球菌对伤科药水的敏感性较好，在含伤科药水36.80 mg/mL的培养基就无法生存，而且伤科药水对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均有较好的敏感性，可用以治疗耐药菌感染。上述结果提示伤科药水作为中药抗感染药物应用有一定的前景。研究表明在一些慢性感染过程中和急性感染的后期使用中药不仅能抗菌消炎，还具有全面的调理作用[14]。但本研究仅在体外对伤科药水的抗菌活性进行评价，其在体内的抗菌效果还有待于进一步探究。