基于网络药理学联合GEO芯片分析干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病的机理和分子靶点

张泽鑫,吴汶丰,谢丹,方舒涵,徐笋晶

(1.广州中医药大学第二临床医学院,广东 广州 510405; 2.广州中医药大学第一附属医院伤寒教研室,广东 广州 510405)

2型糖尿病是以慢性高血糖为主的代谢性疾病，其病因和发病机制复杂，暂无特效稳定的治疗与预防方法[1]。然而2型糖尿病在我国的发病人数不断增多，预计在2030年将达到4 200万[2]，且其并发症及死亡率也不断攀升，亟待寻求有效的预防与降糖治疗方案。随着中医药控制2型糖尿病患者血糖的效果越发显著且副作用较小，采用中医药治疗2型糖尿病也日益成为现在的研究重点。

2型糖尿病在中医属“消渴”范畴，其最核心的病机便是中满内热，脾气损伤。由于现代人多食肥甘厚味，脾胃功能受损，运化失常，因而食郁体内致使湿热内阻，热耗而虚，从而导致糖尿病的发生发展[3]。干姜黄芩黄连人参汤出自《金匮要略》，主治寒热虚实错杂之呕吐。其中干姜味辛善于升发宣散，人参味甘善于益气，属阳；黄连、黄芩味苦能降逆泄下，属阴。将辛温的干姜、甘温的人参与苦寒的黄连、黄芩进行配伍，“一开一降,一补一泄”，与2型糖尿病脾虚胃热，脾胃升降功能失调病机契合，因此干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病，寒温并用,升降同施，效果显著[4]。现代药理学研究表明，干姜中的姜酚有抗氧化、降血脂、抗动脉粥样硬化、保护胃黏膜、消炎镇咳等功能[5]；予姜汁给STZ所致的糖尿病大鼠能显著降低其禁食后血糖水平,并且升高胰岛素在体内的水平[6]。黄连有止呕等作用，且能提高胰岛素作用的敏感性[7]。黄连中成分槲皮素、黄芩成分中黄芩素和人参中成分山奈酚同属黄酮类化合物，皆可显著降低患者的血糖水平[8-9]。基础研究已经显示以上药物的一些通路靶点，但目前对于干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病的机理和分子靶点仍尚未完全研究清楚。

网络药理学可诠释药物“成分—靶点—通路”的整体调节机制，能对药物与疾病的相关性进行预测，对研究中药的多角度作用机制意义重大[10]。GEO数据库是将精选的基因表达数据集以及原始系列和平台记录存储在基因表达综合库，结合网络药理学能实现药物治疗疾病机理和分子靶点的阐释。故本研究将通过网络药理学联合GEO分析的方法，探求干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病的机理和分子靶点。

1 材料与方法

1.1 活性成分筛选

在TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)中分别检索干姜、黄芩、黄连、人参。传统中药多为口服制剂，在人体必然经过吸收、分布、代谢、排泄(ADME)过程才能与靶器官、靶组织结合发挥药效。而经验表明，符合里宾斯基(Lipinski)的类药五原则的先导药物因具有较好的ADME性质而成为潜在的口服药[11]。故将口服生物利用度(OB)设置为≥30%，类药性(DL)设置为≥0.18，限定物种为“Homo sapiens”，以得到其活性成分。

1.2 靶点筛选

在Drugbank数据库中(https://www.drugbank.ca/)导入干姜黄芩黄连人参汤的活性成分，获取对应靶点。

1.3 2型糖尿病GEO芯片热图与火山图绘制

从GEO数据库下载GSE29221芯片与平台数据，使用R软件，设定 P value<0.005 and |log2(fold change)|>1，绘制热图与火山图，将疾病的差异基因导入到excel表格中。

1.4 治疗2型糖尿病分子基因网络图绘制

将干姜黄芩黄连人参汤与2型糖尿病的差异基因取交集后，导入到cytoscape3.7.2中，绘制分子基因网络图，寻找重要的活性分子。

1.5 治疗2型糖尿病基因的拓扑网络构建

将干姜黄芩黄连人参汤与2型糖尿病的差异基因取交集后，导入到cytoscape3.7.2中，使用Bisogenet和CytoNCA，设置计算度中心度(DC)>61，中间度中心度BC>600,构建其拓扑网络，找出重要的候选基因(红色矩形代表最后筛选出的核心基因)。

1.6 治疗2型糖尿病基因GO富集分析

使用R软件，根据干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因，进行GO富集分析。根据基因富集数目与显著程度(pvalueCutoff <0.05,qvalueCutoff<0.05)，选取排名靠前的20条GO生物过程，绘制柱状图。

1.7 治疗2型糖尿病基因KEGG富集分析

使用R软件(此分析程序通过安装colorspace、stringi、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、enrichplot等6个packages进行)，根据干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因，进行KEGG富集分析。根据基因富集数目与显著程度(pvalueCutoff<0.05,qvalueCutoff <0.05)，选取排名靠前的20条KEGG通路，绘制柱状图。

1.8 治疗2型糖尿病通路与基因网络图绘制

将上述KEGG通路导入到cytoscape3.7.2中，根据degree值大小，显示通路与基因的富集程度，绘制网络图。

2 结果

2.1 干姜黄芩黄连人参汤活性成分与靶点

将口服生物利用度(OB)设置为≥30%，类药性(DL)设置为≥0.18，得到与2型糖尿病相关干姜活性成分19个，黄芩20个。黄连7个，人参3个。Drugbank显示成分基因1 078个。结果见表1。

2.2 2型糖尿病GEO芯片热图与火山图绘制

从GEO数据库下载GSE29221芯片与平台数据，共24个样本，使用R软件，绘制热图与火山图，将疾病的差异基因导入到excel表格中。颜色深度代表基因表达程度，颜色越红，基因表达更显著；颜色更绿，基因表达更不显著。见图2。

2.3 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病分子基因网络图

将干姜黄芩黄连人参汤与2型糖尿病的差异基因取交集后，导入到cytoscape3.7.2中，绘制分子基因网络图(图3)，分子MOL00098对应最多的靶点，故可认为是干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病的主要分子。

表1 干姜黄芩黄连人参汤活性成分表Table 1 Active components in GHHR formula

表1 (续)

图1正常人与2型糖尿病患者差异基因热图

Figure1Heat map of differential genes between normal and type 2 diabetic patients

0510-10-586420logFC-log10(P.value)

图2正常人与2型糖尿病患者差异基因火山图

Figure2Volcano map of differential genes between normal and type 2 diabetic patients

图3干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病分子基因网络图

Figure3Molecular gene network diagram of GHHR formula for the treatment of type 2 diabetes

2.4 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因的拓扑网络图

将干姜黄芩黄连人参汤与2型糖尿病的差异基因取交集后，导入到cytoscape3.7.2中，使用Bisogenet和CytoNCA，设置计算度中心度(DC)>61，中间度中心度(BC)>600,构建其拓扑网络。从图4C可以看出，拓扑网络共得到了ERBB2、PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1、AKT1、HSPB1等8个候选基因。

2.5 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因GO富集分析

使用R软件，根据干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因，进行GO富集分析。根据基因富集数目与显著程度，选取排名靠前的20条GO生物过程，绘制柱状图。见图5～图7。

2.6 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因KEGG富集分析

使用R软件，根据干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因，进行KEGG富集分析。根据基因富集数目与显著程度，选取排名靠前的20条KEGG通路，绘制柱状图。见图8。

2.7 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病通路与基因网络图绘制

将上述KEGG通路导入到cytoscape3.7.2中，根据degree值大小，显示通路与基因的富集程度，绘制网络图(图9)。可以看出hsa04066是富集基因数目最多的通路，AKT1、ERBB2、EGF是数目最多的基因。

图4 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因的拓扑网络Figure 4 Topological network of GHHR formula for the treatment of type 2 diabetes

图5干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因生物过程(BP)图
Figure5Biological process (BP) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

图6干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因细胞成分(CC)图
Figure6Cellular component (CC) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

图7干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因分子功能(MF)图
Figure7Molecular function (MF) of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

图8干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病KEGG图

Figure8KEGG of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

图9干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病通路与基因网络图

Figure9Pathway and gene network diagram of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

表2 干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病通路
Table2Pathway of GHHR formula in the treatment of type 2 diabetes

IDDescriptionGeneRatiohsa04066HIF-1 signaling pathway7/38hsa00330Arginine and proline metabolism4/38hsa01522Endocrine resistance5/38hsa00982Drug metabolism-cytochrome P4504/38hsa01524Platinum drug resistance4/38hsa03320PPAR signaling pathway4/38hsa01521EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance4/38hsa04068FoxO signaling pathway5/38hsa04012ErbB signaling pathway4/38hsa00360Phenylalanine metabolism2/38hsa00061Fatty acid biosynthesis2/38

3 讨论

糖尿病的演变主要分为郁、热、虚、损4个阶段[12]，干姜黄芩黄连人参汤针对的就是这几个阶段[13]。因糖尿病的核心病机为中满内热、脾虚胃热，故选用苦寒清胃热之黄连黄芩，并配以干姜护中，人参益气，诸药相合贯穿治疗糖尿病全程。虽然此方在临床上运用较多，但对其治疗2型糖尿病具体的机理和分子靶点研究现仍然较缺乏，因此本研究基于网络药理学联合GEO数据分析，寻找药物相关靶点与作用通路，探讨其治疗2型糖尿病的分子靶点及机理，以期进一步促进临床运用与相关机制研究。

干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病的分子靶点网络由49个化合物和55个化合物靶点组成。结果表明(图3)，大多数化合物作用于多个靶点，如槲皮素、黄芩素和山奈酚分别对32、11、10个靶点起作用，因此它们很可能是干姜黄芩黄连人参汤的多效活性化合物。槲皮素、黄芩素和山奈酚同属黄酮类化合物，前槲皮素具有降血糖、降血脂、抗炎、抑制肿瘤等多种作用[14]，对链脲佐菌素糖尿病大鼠降糖作用显著[15]；黄芩素具有较强的抗氧化作用，与氧化应激关系密切[8]，能够大量降低糖尿病大鼠中的氧自由基，从而改善胰岛功能[16]；山奈酚具有抑制线粒体凋亡途径作用，从而减轻氧化应激对胰岛的损害，从而改善血糖水平[9]。在本研究中，槲皮素、黄芩素和山奈酚调节大多数2型糖尿病的靶点。黄芩黄连是本方的主要用药，针对2型糖尿病的核心病机，与该网络结果相符。此外，上述3种药物成分均具有相对较高的口服生物利用度，因此，它们可能被认定为治疗2型糖尿病的代表性化合物。

在对干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病的55个靶点进行相关蛋白互作网络构建中，为了获得更加准确的结果，对DC和BC在内的2个参数进行设置并构建新的网络，并且根据KEGG通路，结合degree值大小，寻找与通路相关的重要基因ERBB2、AKT1、EGF(图7)，确定了以ERBB2、AKT1、PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1、HSPB1等为主要基因的拓扑网络(图4)。两者相结合，得到主要的候选基因为ERBB2、AKT1。

表皮生长因子受体2(ERBB2),是ROCKs和ERK1/2介导糖尿病诱导的血管功能障碍的上游效应物。改变涉及ErbB2途径的信号转导途径的作用的潜在策略，已被证明对治疗糖尿病引起的血管并发症是有益的[17]。ERBB2存在于 NRG-1/Erb B2中，通过激活该通路能对糖尿病患者减轻其心肌的损伤[18]。EGFR / ERBB2信号传导是重要的心脏生存途径，其激活(特别是在糖尿病，局部缺血或用抑制这种级联的药物治疗后)可以显著改善心脏功能[19]。此外，一项4 420人的队列研究表明，ErbB2水平升高与糖尿病的发病率增加有关[20]。

AKT1是一种蛋白激酶，其激活能促进肝细胞GK mrRNA表达，降低血糖[21]。急性胰腺炎发展过程中，AKT1在控制腺泡细胞增殖和腺泡至导管化生(ADM)形成中的关键作用[22]。AKT1是将胰岛素信号转导至线粒体并调节线粒体复合体V活性的主要同工型。 线粒体AKT1的激活增强了心肌细胞中的ATP产生并增加了磷酸肌酸。 该信号通路的失调可能损害糖尿病心肌的线粒体生物能[23]。

此外，本文还研究了干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病基因的GO(BP、CC、MF)和KEGG富集分析。通过生物过程(图5)、细胞成分(图6)、分子功能(图7)、通路(图8)结合富集程度显著性与数量，筛选出了以response to steroid hormone为主的BP、Steroid hormone receptor activity为主的MF、Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex为主的CC和以HIF-1 为主的信号通路。

Response to steroid hormones是对类固醇激素反应的生物过程，类固醇激素分为肾上腺皮质激素和性激素两大类。超生理剂量的类固醇激素，拮抗胰岛素的降糖作用，干扰细胞内胰岛素的信号传导，减少细胞对葡萄糖的摄取和利用。且协同其他内源性具有升糖作用的激素，增加肾上腺素受体的表达，抑制肾小管对葡萄糖的重吸收，糖代谢出现紊乱，从而出现胰岛 β细胞功能障碍和胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)[24]。美国的全国健康与营养调查中，对1 461例年龄为≥20岁的男性资料进行分析，得出低睾丸激素和高雌二醇可能通过与成年男性的整体和中枢性肥胖相互作用而增加IR和2型糖尿病的风险[25]。雌激素综合征中的雌二醇浓度可能会干扰胰岛素与其受体的结合，从而产生明显的胰岛素耐药性[26]。

Steroid hormone receptor activity是指类固醇激素受体活性，而糖皮质激素受体是类固醇激素受体的一种，研究显示肝内糖皮质激素受体的激活和11beta-HSD1表达可能有助于db/db小鼠发生2型糖尿病[27]。胰腺β细胞中糖皮质激素信号的长期增强导致高血糖症和葡萄糖耐量受损。此作用可能涉及通过alpha(2)-AR参与胰岛素分泌调节的信号通路[28]。

Cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex(细胞周期蛋白依赖性激酶全酶复合物)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一组结构相似且相对分子质量为34 000～40 000的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,大多数 CDK在细胞中,与细胞周期蛋白结合，形成活性激酶复合物，参与调节细胞周期、调控 DNA 转录、信使RNA 加工以及神经细胞的分化[29]抑制CDK5过度激活，可减轻神经元凋亡和认知缺陷，并有助于缓解糖尿病性脑神经毒性[30]。CDK2是将原发性β细胞功能障碍与糖尿病患者进行性β细胞质量恶化联系起来的重要纽带。而胰岛β细胞的衰竭是2型糖尿病主要病因[31]。

综上所述，本研究表明干姜黄芩黄连人参汤治疗2型糖尿病最主要的活性成分为为槲皮素、黄芩素和山奈酚。这些活性成分通过与ERBB2、AKT1、EGF、 PARP1、CDK2、EIF6、AHSA1、CAV1和HSPB1等基因相互作用，通过esponse to steroid hormone生物过程、cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex细胞成分，steroid hormone receptor activity分子功能等作用，单独或者共同调节HIF-1 signaling pathway等通路，从而对2型糖尿病发挥重要治疗作用。