神经血管单元体外模型在川陈皮素抗阿尔茨海默病作用中的应用

赵宇红，陈世坚，文嫒雯，郑凌云，李坤平

(广东药科大学1.药学院； 2.生命科学学院，广东 广州 510006)

阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)是以进行性认知和记忆减退为特征的老年性神经系统慢性退行性病变，随着世界人口的老龄化及AD发病率的不断上升，国外各大医药公司均展开了抗AD药物的研发[1]。目前研究认为，Aβ毒性损伤是AD发生的关键因素，但以Aβ为靶点的药物开发却屡屡受挫，使得对抗AD有效成分发现的源头，即药物筛选模型不得不进行重新审视[2]。在Aβ诱导损伤的拟AD细胞模型中发现,受试成分在不同细胞筛选模型中表现出差异性,神经血管单元 (neurovascular unit,NVU)是脑功能的基本单位,它在体外研究中的作用正逐步得到的认识，本研究拟通过动物实验，比较NOB在体外NVU模型和单纯神经元培养中对Aβ毒性损伤的保护效应，现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级雄性昆明小鼠，体质量25～35 g，用于动物行为学实验，新生3 d SD大鼠，用于细胞培养模型，所有动物均购于广东省实验动物中心，生产许可证号 SCXK(粤)2013-0002。

1.2 主要仪器与试剂

胰酶、胶原酶、阿糖胞苷、谷胺酰(美国Sigma公司)；血清、B27、DMEM/F12、 Neurobasal神经元培养基、青链霉素、庆大霉素(Gibco公司)；Nobiletin(上海江莱生物科技有限公司)；Forma 370型细胞培养箱(美国Thermo公司) ；SW-CJ-1FD超净台、DL-4000B冷冻离心机(苏州江东精密仪器有限公司)；680型酶标仪(Bio-RAD，美国)；SA301立体定位仪(SANS，江苏)； MILLICELL-ERS细胞电阻仪(Millipore， Billerica，美国)。

1.3 体外实验

1.3.1 分组及处理 细胞实验分为模型组、空白对照组、20、40 μmol/L NOB处理组、NOB对照组共5组，NOB处理组先给予不同浓度NOB预孵育4 h后，在小室内给予5 μmol/L 经37 ℃ 孵育120 h的凝聚态Aβ1-42处理24 h；空白对照组给予生理盐水；NOB对照组给予40 μmol/L的NOB处理。

1.3.2 脑皮层神经元培养 参照文献[3]。取新生3 d大鼠，分离大脑皮层并剪碎，0.25%胰酶胰酶消化15 min后,含血清培养液(10% FBS DMEM/F12)终止消化后吹散，沉淀细胞团吸出继续同前法消化到完全。 70 μm滤网过滤，800 r/min离心5 min，含培养液重悬并接种，神经元贴壁后更换含双抗的神经元培养基( neurobasal-A medium、B27)。培养48 h后换含血清培养基，每3天半量换液。

1.3.3 体外 NVU 联合培养

神经胶质细胞的分离培养参照文献[4]，同前法分离两侧大脑皮层并剪碎，胰酶37 ℃消化 15 min后终止消化后吹散，顺序用70 μm及100 μm滤网过滤，滤液在冷冻离心机上800 r/min 离心5 min，弃上清，用加双抗(青霉素100.0 U/mL，链霉素100.0 mg/mL)的含血清培养液重悬、吹散、接种， 37 ℃，5%(φ) CO2条件下培养，第 2天换液。第 4天多次震荡，将粘在瓶底的上层细胞去除。BMECs 细胞的分离培养参照文献[5]报道并改进，上法得到的100 μm滤网上的细胞残渣用无血清培养液重悬，冷冻离心机800 r/min 离心5 min，0.1%Ⅱ型胶原酶同前法消化7 min后终止消化。将冷冻离心机800 r/min 离心5 min，用高糖DMEM(20% FBS、50 μg/mL碱性成纤维细胞生长因子、120 U/mL肝素、2 mmol/LL-谷酰胺、100 U庆大霉素 ) 重悬细胞。同前法接种培养。

参照文献[6]，第1天在插板外表面按5×105/mL接种神经胶质细胞，待细胞融合70% 后反转细胞插板，在内表面接种 BMECs，待2种细胞完全融合后置于预先接种有皮层神经元的 12孔培养板上，共培养3 d左右。

细胞电阻仪测定跨膜电阻值(transendothelial electrical resistance，TEER)值，均在 120～130 Ohm×cm2之间，加入培养液，使培养板液面高于小室内液面0.5 cm，培养箱中观察4 h，看液面差无变化即可开始实验。TEER=单层细胞电阻(Ohm)×膜面积(cm2)。

1.3.4 MTT测定细胞存活情况 实验完成后，加入MTT使终质量浓度为0.5 g/L，继续培养4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，结晶充分溶解后，在酶标仪上波长570/630处测定，细胞存活率(%)=实验组(A570-A630)/对照组(A570-A630)。

1.4 动物实验

1.4.1 分组及处理 实验动物随机分为模型组、假手术组、高、低剂量药物组共4组，每组15只，模型组给予凝聚态Aβ侧脑室注射，假手术组注射同样体积的生理盐水，药物组分别予NOB 25 mg/kg及50 mg/kg腹腔注射，每日1次共10 d，给药第3天侧脑室注射造模，于造模第7天进行行为学测试。模型组及假手术组给予生理盐水腹腔注射。

1.4.2 小鼠Aβ1-42侧脑室注射 用5%(φ)水合氯醛腹腔注射(0.1 mL/10 g)麻醉小鼠后固定于立体定位仪上，参照鼠脑立体定位图谱(第5版,George Paxinos,Keith B J Franklin)[7]，在前囟后0.3 mm，矢状缝侧1 mm位置颅骨开孔，用微量进样器刺入深度2.5 mm，回抽有脑脊液后注入5 μL凝聚态Aβ1-42(410 pmol)，留针1 min后取出，对照组小鼠给予等体积的生理盐水。

1.4.3 新物体辨别实验[8]实验在50 cm×50 cm×25 cm方箱中进行，实验分为3次，第1次将小鼠放入方箱自由活动5 min熟悉环境后取出；5 min后将小鼠第2次面壁放入，此时箱内置有2个大小相同的(6 cm×6 cm×3 cm)异色塑料方块，距箱壁一侧 8 cm 处直线等距排放，记录5 min内探索两物体的时间(TF1，TF2)；10 min后同前法将小鼠第3次放入进行测试，用稍大的不同色塑料方块替换一个旧方块，另一旧方块移到新方块的镜像位置，记录5 min内探索新旧物体的时间(TN，TF)。判定标准：小鼠鼻在1 cm内指向或触及物体则记录为探索行为。分辨指数=(TN-TF)/(TF+TN)×100%。

1.4.4 避暗实验 参考文献[9]方法，小鼠置于自制隔成明暗2个等大小(15 cm×10 cm×10 cm)方箱内，两室有门相通，底部铺金属板，与可开关的电源相连(30 V)；小鼠背向门放入明室，适应环境3 min，开始训练，小鼠进入暗室即通电，训练5 min，48 h后测定3 min内进入暗室的潜伏期和内错误次数。

1.5 统计学方法

采用 SPSS19.0 软件进行统计分析，实验结果中时间指标用其倒数的对数进行比较，采用方差分析进行组内比较，组间两两比较采用 LSD-t，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOB对Aβ1-42诱导单一培养神经元损伤的影响

NOB对照组皮层神经细胞的存活率为102.2%，与空白对照组比较差异无统计学意义，提示NOB无细胞毒性；与空白对照组比较，模型组神经细胞存活率为65.52%，表明Aβ1-42可诱导细胞损伤(P<0.01)；20、40 μmol/L NOB处理组皮层神经细胞存活率分别为67.46%和72.16%，与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图1，提示NOB处理不能改善Aβ1-42可诱导细胞损伤。

2.2 NOB对NVU模型中Aβ1-42诱导损伤神经元的影响

在NVU体外联合培养模型中，NOB对照组皮层神经细胞的存活率为105.8%，与空白对照组相比差异无统计学意义；与空白对照组相比，模型组神经细胞存活率为62.64%，表明Aβ1-42可诱导细胞损伤(P<0.01)；20、40 μmol/L NOB处理组皮层神经细胞存活率分别为79.68%和90.83%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

12080400存活率/%12345****####

1.空白对照组; 2.模型组; 3. 20 μmol/L NOB处理组;

4. 40 μmol/L NOB处理组; 5. NOB对照组(下图同)。

与模型组比较：**P<0.01；与空白对照组比较：##P<0.01。

图1NOB对单一培养神经元Aβ1-42损伤的神经元存活率的影响

Figure1Effect of NOB on the survival rate of single cultured neurons damaged by Aβ1-42(n=12)

****##*#*12080400存活率/%12345

与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01；与空白对照组比较：#P<0.05，##P<0.01。

图2NOB对NVU联合培养中Aβ1-42损伤的神经元存活率的影响

Figure2Effect of NOB on the survival rate of neurons injured by Aβ1-42in NVU co-culture(n=12)

2.3 NOB对Aβ1-42小侧脑定注射模型小鼠避暗实验的影响

与假手术组比较，模型组小鼠的回避潜伏期明显减少(P<0.05)，错误次数增加(P<0.05)，提示模型小鼠记忆下降。与模型组相比，25、50 mg/kg NOB可使回避潜伏期明显增加(P<0.05)，减少错误次数(P<0.05)，提示NOB可改善模型小鼠的记忆能力。见表1。

组别剂量/(mg·kg-1)潜伏期/s错误次数/次假手术组-135.31±35.40 0.72±0.30 模型组-75.12±13.66#2.17±0.56 #NOB25121.69±29.10∗ 0.76±0.35∗ 50154.01±33.31∗0.63±0.31∗

与模型组比较：*P<0.05；与假手术组比较：#P<0.05。

2.4 NOB对Aβ1-42小侧脑定注射模型小鼠新物体识别实验的影响

训练期各组小鼠对两物体的探索时间差异无统计学意义，表明小鼠对两物体无偏好，与假手术组相比，模型组对新物体的探索时间显著缩短(P<0.05)，分辨指数下降(P<0.01)；与模型组组相比，25、50 mg/kg NOB均可提高模型小鼠对新物体的探索时间(P值均<0.05)及分辨指数(P值均<0.01)，见表2～表3。

表2 NOB对小鼠训练期探索时间的影响Table 2 Effect of NOB on exploring time of training period in mice

与模型组比较：*P<0.05；与假手术组比较：#P<0.05。

表3 NOB对小鼠测试期探索时间及对新物体分辨指数的影响Table 3 Effect of NOB on the exploration time and resolution index of new objects in the test period of

与假手术组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01。

3 讨论

NOB是中药陈皮的有效成分，为多甲氧黄酮结构，具有多种生物活性[10]。实验研究发现，它可改善高血压大鼠的血管内皮细胞功能[11]，保护高糖诱导的血管内皮损伤[12]，并改善LPS诱导的胶质细胞的活化[13]，具有抗AD的潜能，其抗AD作用及机制值得进一步研究。

在中药抗AD活性成分的机制研究中，常采用细胞模型，目前常用的神经细胞模型可分为原代细胞培养模型、杂交系细胞培养模型(如小鼠成神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤融合杂交的NG108-15细胞系，畸胎瘤AD杂交细胞NT2等)、恶性细胞来源的细胞系(如神经源的小鼠胚胎癌细胞株P19细胞)、及基因工程细胞株培养模型(如PC12、HT22细胞)，这些细胞模型多为单一细胞培养模型，可较深入地反映待测活性成分在某一特定抗AD机制中的作用，如畸胎瘤AD杂交细胞NT2就可以较好的呈现线粒体功能异常导致的Aβ沉积变化过程。但在AD的发生过程中，诱导AD发生的促进因素常存在生理制约，表现出多个促发因素联动(包括血管供给、炎性激活、修复异常等)引起的缓慢进程，其间常有脑内多种细胞的参与及功能的失协调，因此，采用单一细胞模型筛出的活性成分常存在与动物实验结果不一致的情况。

近年来对脑功能的研究[14]提出了NVU的理念，认为NVU是脑功能的基本单位，中枢神经系统结构和功能的完整性取决于NVU的协调活动，即脑内神经活动与血流之间的耦合过程，NVU在多种神经退行性疾病进程中的变化与均与疾病的发展呈现一致性，它的核心构成细胞是神经元、胶质细胞和血管内皮细胞，各类型细胞之间的相互作用，是大脑功能调节的物质基础。NVU作为一个整体在神经退行性疾病进展中的作用正在得到逐步的认识[15-16]。

在NOB抗AD活性研究中，本研究发现，在单一皮层神经细胞元体外培养体系中，NOB对Aβ诱导的单一皮层神经细胞元损伤无明显保护作用，在Aβ诱导损伤前给予20、40 μmol/L NOB处理，其细胞存活率分别为67.46%和72.16%，与模型组(65.52%)相比差异无统计学意义；但在NVU联合细胞体外培养体系中，NOB对Aβ诱导的神经元可以产生保护作用，在Aβ诱导损伤前给予20、40 μmol/L NOB处理，其细胞存活率分别为79.68%和90.83%，与模型组(62.64%)相比差异有统计学意义。

动物实验结果表明，Aβ1-42侧脑定注射拟AD模型小鼠中，NOB可显著提高小鼠回避潜伏期，减少错误次数，提高新物体识别测试中对新物体的分辨指数，改善拟AD模型小鼠的认知行为，与文献[17]报道一致，提示以单一的神经元培养作为体外模型进行抗AD有效成分的筛选存在一定的盲区，而NVU模型可以减少盲区，与体内神经血管的相互作用环境更为接近，有更好的一致性。

NOB在两种体外模型中的差异性，也同时表明其抗AD作用有多种细胞及因素参与，是多靶体机制的共同效应，可能与其对NVU中神经胶质细胞对Aβ的反应调节及对Aβ诱导BMECs损伤保护作用有关，需进一步的实验证实。而NVU联合培养模型与活体动物实验更为接近，可作为多靶点抗AD活性成分机制研究的较好载体。