药代动力学实验室液相色谱串联质谱仪期间核查方法的建立

金冠钦，孙黎，王玉洪，夏玲红，林厚文

（上海交通大学医学院附属仁济医院药学部，上海 200127）

随着检测技术的迅速发展，高效液相色谱串联质谱技术(LC–MS／MS)以其分析时间迅速、分离能力强、操作相对便捷的优势在国内外药代动力学实验室中备受青睐。然而，使用者虽能准确熟练操作，但对于如何自行对液相色谱质谱联用仪进行性能考察，以验证其检测结果的质量，尚无统一、系统的方法可供参考。2010 年，福建省率先出台首部《JJF( 闽)1032–2010 液相色谱–质谱联用仪校准规范》［1］，首次细化液相色谱–质谱联用仪的校准要求，并形成规定；2011年，颁布了全国性校准规范指导文件《JJF1317–2011 液 相 色 谱– 质 谱 联 用 仪 校 准 规 范》［2］， 明确了液相色谱–质谱联用仪进行性能考察的参数指标，为其开展期间核查奠定了基础。

作为国内较早通过ISO／IEC 17025 认可的实验室，上海交通大学医学院附属仁济医院临床药理实验室自2010 年起运行体系，分别从质量手册、程序文件以及标准操作规程三个层次对实验室仪器进行有效管理。新版指导性文件CNAS CL–01: 2018对仪器设备的期间核查内容进行了更新，其中6.4.4和6.4.10 条款对设备的验证和核查提出了明确要 求［3］。开展期间核查的目的是为了保证设备的可信度，在两次的检定或校准期间，验证仪器的运行状态，确定其状态的保持情况，防止因仪器设备出现意外偏离而影响检测结果的准确性［4］。LC–MS／MS既是药物浓度检测最重要且常用的工具，也是准确度要求较高的关键设备［5］。液相色谱–质谱联用仪作为CNAS 资质认定的检测能力要求之一，对其状态考察更是实验室仪器管理的重中之重［6］。本实验室制定相关标准操作规程，结合国内外经验［7–8］，从状态及性能核查、仪器比对、全国实验室间质评等多角度，建立对液相色谱–质谱联用仪的期间核查方法，以确保其检测结果的有效性及准确性。笔者以API 3200 QTrap 三重四级杆液相色谱–质谱联用仪为例，详细介绍其期间核查的方法。

1 实验方法

实验室根据仪器检定规程、厂家提供的使用说明及国家计量检定规范，并结合自身的实际情况，制定了针对液相色谱质谱联用仪期间核查的标准操作规程。期间核查包括：状态及性能核查、仪器比对、室间质评三方面。

1.1 状态及性能核查

状态及性能核查使用公式(1)～(5)。

式中：SS——泵流量准确性，%；

SR——泵流量稳定性，%；

Fs——流量设定值，mL／min；

Fmax——同一设定流量3 次测量值的最大值， mL／min；

Fmin——同一设定流量3 次测量值的最小值， mL／min；

Fm——流量实测值，mL／min；

w2——容量瓶与流动相的质量之和，g；

w1——容量瓶的质量，g；

ρt——实验温度下流动相的密度，g／cm3；

t——收集流动相的时间，min。

式中：ΔM——质量准确性，u；

Mia——第i 个离子的测量值，u；

Mib——第i 个离子的理论值，u。

式中：RSD——测定结果的相对标准偏差；%；

xi——第i 次测量保留时间(min)或色谱峰面积；

i——测量序号。

1.1.1 泵流量稳定性(SR)及泵流量准确性(SS)

液相色谱–质谱联用仪由高效液相色谱仪及三重四级杆质谱仪串联组成，高效液相色谱仪的流量对于样品出峰时间，峰型以及峰面积均有影响。由于该高效液相色谱仪与质谱配套使用，液相部分常规的流量设置均小于1 mL／min，故只需考察0.5 mL／min 及1 mL／min 两个流量点，取消对大于1 mL／min 流量的核查。在测试开始前连接输液系统、进样器，流动相为纯化水，打开阀门，于废液出口用10 mL 容量瓶(容量瓶已称定空瓶重量，且经华东国家计量测试中心检定合格)收集流动相。用秒表计时，其中0.5 mL／min 流量的收集时间为10 min，1.0 mL／min 流量的收集时间为5 min，收集结束后于经检定合格的电子天平上称定重量，每个流量分别重复测量3 次。测定过程中用经检定的温度计对水温进行实时测定，以计算纯化水重量。按公式(3)计算流量实测值Fm，按公式(1)和公式(2)计算SS和SR。要求流量为0.5 mL／min 的泵流量设定值误差不大于5%，泵流量准确性误差不大于3%；流量为1.0 mL／min 的泵流量设定值误差不大于3%，泵流量准确性误差不大于2%。

1.1.2 质量范围、质量数准确性、分辨力

(1) 依 据《JJF1317–2011 液 相 色 谱– 质 谱 联用仪校准规范》中关于标准物质或试剂的要求，实验选择聚醚多元醇（PPG）作为仪器调谐液，利用PPG425，PPG1000，PPG2000 混合溶液对质量数应用范围大于1 000 的质谱仪进行校准调谐。实验室常用的电离模式为ESI 模式，故期间核查针对ESI正离子及负离子进行考察。正离子模式下，分别于Q1 及Q3 采 用59.050，175.133，616.464，906.673，1 254.925，1 545.134 六个离子进行测试；负离子模式 下 则 采 用44.998，585.385，933.636，1 223.845，1 572.097 进行测试，根据测试结果记录可使用的质量范围。

(2)质量准确性判定时，将PPG 混合液直接针泵注入液相色谱质谱联用仪离子源，分别使用上述离子理论值±5 的范围进行扫描，根据公式(4)计算ΔM，以ΔM 的最大值作为质量准确性的结果，要求液相色谱质谱联用仪的质量准确性ΔM ≤0.5 u。

(3)分辨力测试需等待仪器运行稳定后，仍使用针泵将PPG 混合液注入离子源，直接考察6 个离子的半峰宽(W1／2)，作为分辨力的结果。要求本实验室液相色谱质谱联用仪的分辨力不大于1 u。

以上三个参数均可通过PPG 混合液进行测试。在测试过程中，分辨力可通过改变offset 值进行调整，整体响应值的大小可通过改变IE 值调整。当各参数调整至满意结果后，则更新数据完成仪器的自校准。正、负离子模式下PPG 溶液全扫描10 次叠加质谱图见图1。

1.1.3 信噪比

在ESI 正离子模式下，使用50 pg／μL 利血平标准溶液，经WATERS XBridge C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)注入液相色谱质谱联用仪，观察色谱图，记录色谱峰高Hs以及信号峰后1～3 min的基线输出信号Hn，并计算信噪比S／N，连续测量6次，以6 次测量S／N 的平均值作为信噪比结果。要求信噪比不小于50∶1；ESI 负离子模式下，采用100 pg／μL 氯霉素标准液，按上述方法测定信噪比，要求信噪比不小于20∶1。

1.1.4 色谱峰面积重复性与保留时间重复性

在ESI 正 离 子 模 式 下，使 用50 pg／μL 利血平标准液，经WATERS XBridge C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)注入1 μL 进入液相色谱质谱联用仪，记录其色谱峰面积和保留时间，连续测量6 次。由公式(5)分别计算色谱峰面积与保留时间的相对标准偏差(RSD)，作为色谱峰面积重复性与保留时间重复性的结果。ESI 负离子模式下，采用100 pg／uL 氯霉素标准液，按上述操作方法测定。要求ESI 正负离子模式下的色谱峰面积重复性RSD ≤6%，保留时间重复性RSD ≤2%。正、负离子模式下，利血平(m／z=609.3 →195.1)及氯霉素(m／z=321.0 →152.0)的典型色谱图见图2。

图1 PPG 溶液全扫描质谱图

图2 利血平及氯霉素典型色谱图

1.2 仪器比对

仪器比对是与相同准确度等级的另一个仪器的量值进行比较，利用比较结果完成核查［9］。通过对实验室各仪器间的相互比对，可考察同一待测物在不同仪器下测试结果的准确性及可靠性［10］。

1.2.1 比对仪器

仪器1：API 3200Trap 型串联四级杆质谱系统，岛津LC–20ADXR 色谱系统；

仪器2：API 4000 型串联四级杆质谱系统，岛津LC–20ADXR 色谱系统。

1.2.2 药品

氧氟沙星对照品：纯度为99.7%，批号为130454–201206，中国食品药品检定研究院；

内标物环丙沙星对照品：纯度为99.8%，批号为130451–201203，中国食品药品检定研究院。

1.2.3 测试条件、样品处理与溶液配制

(1)色谱条件。色谱柱：Waters BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相比例：甲醇–0.5%甲酸水(体积比为20∶80)。

(2)质谱条件。电喷雾离子源(ESI)；正离子多反应监测(MRM)；离子喷射电压：5 500 V；离子源温度：600℃；去簇电压：50 V；碰撞电压：20 V；氧氟沙星、环丙沙星离子反应对分别为m／z 362.1 →m／z318.0，m／z 332.4 →m／z 288.2。

(3)血浆样品处理。精密吸取100 μL 血浆，转移至1.5 mL 的PEEK 管中，再加入300 μL 含内标环丙沙星浓度为100 ng／mL 的甲醇溶液，置于涡旋振荡器上振荡1 min，15 000 r／min 离心得沉淀蛋白，取100 μL 上清液转移至另一PEEK 管内，再加入300 μL 含0.5%甲酸的水溶液，涡旋混匀1 min后转移至自动进样小瓶待测。

(4)溶液配制。①体外标准溶液的制备：精密称取氧氟沙星标准品18.60 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，得741.8 μg／mL 的标准液作为储备液，然后用甲醇稀释得1，2，4，10，20，40，100 μg／mL 体外系列标准工作溶液。②体内标准溶液的制备：分别取上述体外系列标准工作溶液各10 μL，分别加入空白血浆190 μL，得到50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 ng／mL 的体内系列标准工作溶液，再按1.2.3(3)方法处理即得。

1.3 实验室间质评

实验室间质评作为保证检测准确可靠的必要手段［11］，已成为国内外衡量ISO17025 认可实验室检测能力的风向标［12–13］。本实验室自2015 年始，至今已参加4 次由国家临床检验中心发起的全国药代动力学实验室间质评活动(计划编码：NCCL–PH–01)，成绩全部为“满意”。HPLC–MS／MS 法测定人血浆卡马西平的浓度系成熟稳定的测定方 法［14–15］，适合作为室间质评方法对仪器进行考察。实验室将全国室间质评纳入仪器检测结果质量保证体系中，以期从实际出发，对液相色谱质谱联用仪的性能进行评价。

1.3.1 药品

卡马西平对照品：纯度为99.7%，批号为100142–201105，中国食品药品检定研究院；

内标物(IS)卡马西平–D10 对照品：纯度为100%，批号为FN06241603，美国西格玛奥德里奇公司。

1.3.2 测试条件、样品处理与溶液配制

(1)色谱条件。色谱柱：Waters XBridgeTMC18柱（3.5μm，2.1×100 mm）；保护柱：Waters XBridgeTMC18柱（3.5μm，4.6×20 mm）；流动相：0.2%甲酸水溶液–乙腈；流量：0.4 mL／min；梯度洗脱：0.10 min 为0.2%甲酸水溶液–乙腈(90∶10)，0.40 min为0.2%甲酸水溶液–乙腈(5∶95)，3.00 min 为0.2%甲酸水溶液–乙腈(5∶95)，3.30 min 为0.2%甲酸水溶液–乙腈(90∶10)，4.00 min 停止。

(2)质谱条件。电喷雾离子源(ESI)，正离子多反应监测(MRM)，离子喷射电压：5 000 V，离子源温度：650℃；去簇电压：66 V；碰撞电压：25 V；卡马西平及内标离子反应对分别为m／z 237.2 →m／

z 194.2，m／z 247.2 →m／z 204.2。

(3)血浆样品处理。取血浆40 μL 置于2 mL的PEEK 管中，加入乙腈溶液(含内标物卡马西平–D10 浓度为10 ng／mL)360 μL，用涡旋混合器振荡3 min，混匀后于13 000 r／min、15℃下离心5 min，取上清液40 μL 加入至360 μL 的10%乙腈水溶液中，涡旋振荡1 min，再于13 000 r／min、15℃离心5 min，取上清液300 μL转移至进样瓶中待测。

(4)溶液配制。①体外标准溶液的制备：精密称取卡马西平标准品20.66 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，得205.98 μg／mL 的卡马西平标准液作为储备液，取3 mL 储备液用50%甲醇水溶液稀释至50 mL，得12.359 μg／mL 卡马西平标准液，并逐级对半稀释，得6.179，3.09，1.545，0.772，0.386 μg／mL体外系列标准工作溶液。②体内标准溶液的制备：分别取上述体外系列标准工作溶液各40 μL，分别加入空白血浆360 μL，得到38.6，77.2，154.5，309，617.9，1235.9 ng／mL 的体内系列标准工作溶液，再按上述“1.3.2(3)”方法处理即得。

正离子模式下，卡马西平（m/z=237. 2 →194. 2）及内标物卡马西平–D10（m/z=247. 2 →204. 2）的典型色谱图见图3、图4。

图3 卡马西平色谱图(m／z=237.2 →194.2)

图4 卡马西平–D10 色谱图(m／z=247.2 →204.2)

2 结果与讨论

2.1 状态及性能核查结果

通过对API3200 QTrap 的各技术指标的核查，结果均合格，故2019 年度液相色谱质谱联用仪状态及性能核查通过，结果详见表2 及表3。

表2 2019 年度液相色谱质谱联用仪状态及性能核查结果(质谱)

表3 2019 年度液相色谱质谱联用仪状态及性能核查结果(液相)

2.2 仪器比对结果

两台仪器分别测定同一个未知浓度氧氟沙星血浆样品，测定10 次。统计方法依次采用格鲁布斯(Grubbs)检验剔除离群数值、F 检验判断两组数据精密度有无差异、t 检验判断两组数据均值有无差异。只有在F 检验和t 检验都显示两组数据无差异后，才能认定通过比对证明出具的检测结果准确、可靠，具有可比性。

结果表明，两台仪器的10 次检测数据经Grubbs检验后发现均无离群值需剔除，氧氟沙星的检测浓度分别为(680.7±6.57) ng／mL 和(684.7±12.41) ng／mL，均值和方差经t 检验和F 检验发现均无显著性差异，且两台仪器的精密度RSD ＜2%(小于15%为合格)，且准确度分别为97.24%，97.81%(判定合格标准为85%～115%)，结果见表4。

表4 2019 年度仪器比对数据统计结果 ng／mL

2.3 全国室间质评结果

使用API 3200QTrap 对5 个盲样进行检测，样品结果均为满意，实验室以满分100 分通过2019 年度全国药代动力学实验室间质评活动，结果见表5。

表5 2019 年度全国药代动力学实验室间质评盲样测试结果

3 结论

在液相色谱质谱联用仪期间核查的过程中，标准物质、相关仪器量具的检定校准情况、仪器日常维护等也是影响其准确度的重要因素。据此，实验室采取一系列措施，确保仪器期间核查数据的准确性。

（1）实验室对标准物质实行有效管理，首选购买可溯源至SI 单位［16］的生产单位，到目前为止均购自中国食品药品检定研究院；实验室制定标准物质档案，对每个标准物质的购买时间、规格、数量、厂家、批号、保存条件等进行登记；每季度开展标准物质期间核查，检查标准物质性状、标签及有效期限。

（2）ISO 17025 体系重视仪器设备的准确性和可溯源性［17–18］，故实验室在年度校准操作规程的基础上，每年制定计量溯源性计划，对实验室仪器开展校准工作，包括对液相色谱–质谱联用仪期间核查时测量影响较大的玻璃器皿，建立合适的校准周期，并安排由华东国家计量测试中心完成校准检定。在经过检定校准后，判定其性能指标合格，贴标签进行标识。

（3）实验室专门制定《仪器设备的控制与管理程序》，以应对仪器的日常维护保养工作，对包括液相色谱质谱联用仪在内的重要仪器的维护保养，均作出具体要求。实验室每天两次监控检测室温湿度，检测室常年保持25℃温度和40%～70%湿度；每月更换液相色谱部分的滤头浸泡液，流动相每3 日更新；每两周定期检查更换清洗管路用的50%异丙醇，每6 个月更换质谱抽真空用的机械泵机油，使仪器保持合适的真空度；每2 个月清洗质谱仪空气过滤网；定期更换液相质谱连接塑料管路，清洗喷针以及interface Q1，Curtain Plate，Orifice 等离子源部件，以防系统污染，影响检测质量。

本实验室根据自身条件，结合液相色谱质谱联用仪的参考标准及相关规范，制定期间核查方法。本次期间核查由于检测器材的限制，未对柱温箱及色谱柱进行考察，今后将增加对柱温箱温度的准确度、以及使用不同色谱柱仪器的出峰情况等方面的核查。实验室严格按照期间核查的结果对液相色谱质谱联用仪进行判定，如果发现超出使用要求，均应立即停用，并对其进行隔离或加贴标签清晰标明以防止误用。对于发现的问题，依据CNAS 规定及时启动不符合项工作程序的管理［19］。液相色谱质谱联用仪是灵敏度高的精密仪器，定期开展对关键性仪器设备期间核查活动，已成为ISO 17025 认可实验室一项重要的日常工作之 一［20］。定期实施期间核查可显著提高检测质量，降低检测过程中差错发生率，持续保持设备校准状态的可信度［21］。