基于液相色谱原理的黄曲霉毒素测定仪校准方法

杨宇，尚梦帆，贾会，冯帅博，李军伟

（1.河南省计量科学研究院，郑州 450008； 2.河南省花生及制品质量监督检验中心，河南正阳 463600）

黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是由真菌寄生曲霉和黄曲霉菌等产生的次级代谢物［1］，是一组化学结构类似的化合物，具有高毒性和高致癌性。1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为I 类致癌物［2–4］。目前发现的黄曲霉毒素及其衍生物有20 多种，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)是已知的化学物质中致癌性最强的一种［5］，也是在天然食物中最为多见的一种，极易污染玉米、花生、食用植物油、饲料等；AFB1 是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，其毒性作用主要表现为对肝脏的损害，其毒性是氰化钾的10 倍、砒霜的68 倍，因此世界各国均对食品中AFB1 含量作了非常严格的限定［6–9］。我国2015 版药典规定大枣、决明子、麦芽、胖大海、莲子等19 个品种必须检测黄曲霉毒素；黄曲霉毒素B1 也是原国家质检总局规定大部分食品的必检项目之一，因此对黄曲霉毒素类测定仪进行定期校准非常有必要。

黄曲霉毒素测定仪集成了液相色谱系统、柱后光化学衍生模块、固定光路荧光检测模块(激发波长为360 nm，发射波长为440 nm)，其最小检测浓度、线性范围、重复性等指标均符合国家标准及相关法规要求［10］。其中荧光检测模块特点是选择性、灵敏度高，而且仅对荧光物质有响应，适合于多环芳烃及各种荧光物质的痕量分析；同时也可用于检测不发荧光但经化学反应后可发荧光的物质。例如在酚类分析中，多数酚类不发荧光，为此先经处理使其变为荧光物质，而后进行分析［11］。此类黄曲霉毒素测定仪现已在粮食、食品、饲料、药材等相关领域有较为广泛的应用，并有不断增长的趋势。笔者选用ALC10 型黄曲霉毒素专用测定仪，具有一定的产品优势，如相对于配备衍生装置和荧光检测器的通用型液相色谱ALC10 具有更高的性价比；ALC10 内置标准应用方法，采用一键式操作，在充分保证数据准确性的前提下，操作简单便捷，极大地提高了分析效率，AFB1 衍生后的荧光信号增强达30 倍以上，因此该仪器具有分析速度快、选择性好、检测灵敏度高等特点，能够有效满足其校准通用技术要求以及各项试验需求。

目前，AFB1 的检测方法主要有酶联免疫法、高效液相色谱法、薄层层析法等［12–13］，这些方法虽然具有检出限低、灵敏度高等优点［14］，但样品处理过程复杂，检测费时且需要专业人员操作，而且针对该类黄曲霉毒素专用测定仪尚没有相应的国家和地方计量检定规程或校准规规范。我国作为农业大国且食品工业相对发达，建立该校准方法具有特别的必要性和迫切性。笔者参考GBT 36858–2018 《饲料中黄曲霉毒素B1 的测定 高效液相色谱法》［15］、JJG 705–2014 《液相色谱仪检定规程》［16］以及仪器说明书，对黄曲霉毒素测定仪动态基线漂移及长期基线噪声、线性相关系数、最小检测浓度、定性定量重复性等主要计量项目和技术指标进行探讨。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

黄曲霉毒素测定仪：ALC10 型，配有输液泵、Working Station 数据库版工作站，济南海能仪器股份有限公司；

甲醇中黄曲霉毒素B1 标准溶液：1.96 µg／mL，扩展不确定度为0.09 µg／mL(k=2)，编号为GBW(E) 100302，国家粮食局科学研究院；

甲醇、乙腈：色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

数字温度计：测量范围为0～100℃，最大允许误差为±0.3℃，合肥常宏测控技术有限责任公司；

分析天平：感量为0.1 mg，上海天平仪器厂；

秒表：最小分度值不大于0.1 s，上海秒表厂；

注射器：100 μL，1 mL和10 mL注射器各一支，北京玻璃仪器集团公司；

容量瓶：10 mL 容量瓶若干，北京玻璃仪器集团公司；

上述设备应具备有效期内的检定证书。

1.2 环境条件

环境温度为：15～30℃；相对湿度为：20%～80%；供压电源：电压为(220±22) V，频率为(50±1) Hz；仪器应平稳地放在工作台上，周围应无强烈机械震动，无强电磁场干扰，且仪器接地良好。

1.3 系列标准工作溶液配制

用流动相为68%A 相（水）–32%B 相（体积比为1∶1 的乙腈–甲醇）稀释甲醇中AFB1 标准溶液，配制成AFB1 系列标准工作液,质量浓度依次为0.1，0.5，2，5，10，20，40 ng／mL。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：40℃(温差控制范围为±2℃)；柱流量：1.0 mL／min；进样体积：50 μL 定量环满环进样；时间常数：高；检测波长：激发波长为360 nm，发射波长为440 nm；动态基线漂移及长期噪声的基线测试用流动相为甲醇；其余校准项目的流动相：A相为水，B相为乙腈–甲醇(体积比为1∶1)，等梯度洗脱：68%A–32%B。

1.5 校准项目和校准方法

1.5.1 通用技术要求

按照相关通用技术要求，对仪器标牌上名称、型号、制造厂名、出厂编号、生产日期、制造计量器具许可证计编号等内容的标识进行逐项检查。仪器外观不应存在妨碍正常工作的机械损伤；样品池及液路无泄漏；仪器电源线、信号线等插接紧密，各开关、旋钮、按键等功能正常；指示灯灵敏，显示器清晰；仪器在不工作的状态下，当试验电压为500 V 时，电源插头的相线与仪器机壳外露金属部分之间的绝缘电阻应不小于20 MΩ。

1.5.2 动态基线漂移及长期基线噪声

选用C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0 mL／min，设置仪器参数后平衡系统，待系统稳定后开始记录基线1 h。用1 h 内基线偏离起始点最大响应信号值(counts／h)作为该检测器动态基线漂移，即以1 h 偏离起始点最大信号值与起始点之差作为该仪器的动态基线漂移值，如图1 所示。

图1 长期基线P–P 噪声计算示意图

在以上1 h 基线范围内选取所记录基线中噪声较大的30 min 作为计算长期噪声的基线，使用30 min 范围内的所有数据点计算出线性回归方程。将给定时间范围内所有数据点减去线性回归线，获得漂移修正信号。然后按式(1)计算动态长期峰到峰噪声，即所选30 min 范围漂移最大值与最小值之差作为该检测器的长期基线噪声值。(亦可参考通过色谱系统软件直接计算P–P 噪声)。

式中：Nd——长期基线噪声；

Imax——选定的30 min 范围内漂移修正信号 的最高峰；

Imin——选定的30 min 范围内漂移修正信号 的最低峰。

1.5.3 线性相关系数

按1.4 色谱条件运行，待压力、基线稳定后，利用手动进样的方式，用50 μL 定量环(满环进样)由低浓度到高浓度依次进样测定1.3 中配制的AFB1 系列标准工作溶液，记录色谱图。重复测量3次色谱峰面积，取算术平均值，以色谱峰面积为纵坐标、以AFB1 的质量浓度为横坐标进行线性回归，计算标准曲线回归方程和线性相关系数r。

1.5.4 最小检测浓度

最小检测浓度是指检测器恰能产生与噪声相区别的响应信号时所需的最小进样量，是表征仪器极限检测能力的重要指标，常用浓度(或质量)表示。被测量仪器的最小检测浓度则表示该仪器的检测能力与极限，其值越小表明该仪器检测能力越强。按1.4 色谱条件运行，待压力、基线稳定后，用100 μL 微量注射器进样测定0.1 ng／mL 的AFB1 标准溶液，采集色谱图，并记录色谱图中AFB1 的色谱峰高和基线噪声峰高，按式(2)计算最小检测浓度：

式中：cL——最小检测浓度，ng／mL；

Nd——基线噪声峰高；

c——AFB1 标准溶液浓度，ng／mL；

V——进样体积，μL；

H——色谱图中AFB1 的色谱峰高；

50——标准的定量进样体积，μL。

1.5.5 定性、定量重复性

按1.4 色谱条件运行，待压力、基线稳定后，用100 μL 微量注射器进样测定2.0 ng／mL 的AFB1标准溶液，记录色谱图，重复测量7 次。将色谱图测试数据中的保留时间和峰面积分别代入公式(3)计算仪器的定性、定量重复性：

式中：RSD——测量重复性相对标准偏差，%；

Xi——保留时间(或峰面积)第i 次测得的测量结果；

X——保留时间(或峰面积)n 次测量结果的算术平均值；

n——测量次数，n=7。

2 结果与讨论

以ALC10 型黄曲霉毒素专用测定仪为例，按上述校准方法和校准项目进行校准试验。

2.1 通用技术要求检查

按照1.5.1 对仪器外观等逐项进行检查，仪器符合通用技术要求中各项内容。

2.2 动态基线漂移及长期基线噪声

通常情况下仪器检测器的基线稳定性可由噪声和漂移两项指标来判定，其中基线噪声与检测器本身性能、检测器与数据处理系统的机械噪声或者电信号噪声密切相关。仪器漂移一般是指由于测量仪器计量特性的变化引起的示值在一定时间内的连续或者增量变化，而产生基线漂移的原因多是由于仪器受到温度、压力、湿度等变化所引起；或是由于仪器本身性能的不稳定影响。故测量仪器在使用时应采取预热、预先放置一段时间等措施以减少漂移。按照1.5.2 进行动态基线漂移及长期基线噪声的测量，结果如图2 所示。计算可得该黄曲霉毒素测定仪所选定30 min 范围内的基线噪声为117 counts，其基线漂移为204 counts／h。

图2 动态基线漂移及长期基线噪声测量结果图

2.3 线性相关系数

线性相关系数是影响仪器测量结果精密度与准确度的重要因素，被测仪器的相关系数越接近于1，则说明两个变量的相关性越强，即该仪器在线性范围内可得到更为准确可靠的测量结果。按照1.5.3依次测定AFB1 系列标准工作溶液，结果见表1。计算得其线性回归方程为y=457 299x+205 354.442 69，线性相关系数r=0.999 2。

表1 标准曲线试样的测量结果

2.4 最小检测浓度

按1.5.4 对该测定仪进行最小检测浓度测量并记录其色谱图，结果如图3 所示。按式(2)计算得该测定仪检测器的最小检测浓度为0.005 ng／mL。

图3 最小检出浓度测量结果图

2.5 定性、定量重复性

测量结果的重复性用相对标准偏差表示［17］。测量重复性反映各种随机因素对测量结果的影响，包括所用的计量标准、环境条件、配套仪器等因素以及测量的重复性。仪器测量重复性一般包括定性重复性和定量重复性［18］。按1.5.5 对该测定仪的定性、定量重复性进行试验，色谱保留时间及色谱峰面积测量值见表2，色谱图如图4 所示。按式(3)计算得该黄曲霉毒素测定仪的定性重复性(RSD)为0.6%，定量重复性(RSD)为1.5%。

图4 定性定量重复性测量结果图

表2 定性、定量重复性测量结果

校准结果的表达应按照JJF 1071–2010 《国家计量校准规范编写规则》技术规范要求［19］，包括标题、被校单位的名称和地址、校准日期、校准所用量标准的溯源性及有效性说明、校准环境等。另外，为全面评估黄曲霉毒素测定仪的综合性能，所有校准项目及校准结果均应在校准证书中有所反映。仪器的测量不确定度来源于所用的测量仪器或者测量系统引起的测量不确定度的分量，而针对该类测定仪校准结果的总不确定度则选择以黄曲霉毒素B1 最小检测浓度的不确定度表示。

3 计量性能指标要求

考虑厂家仪器的出厂参数，根据上述实验结果，以及2019 年度定期实验结果，再结合厂家多次实验数据，总结出黄曲霉毒素测定仪主要计量性能指标，应符合表3 要求，则黄曲霉毒素测定仪性能正常，且量值溯源准确可靠［18］。

表3 主要计量性能指标参考要求

5 结语

建立了黄曲霉毒素测定仪的校准方法。利用甲醇中黄曲霉毒素B1 标准溶液对黄曲霉毒素测定仪进行校准的方法是可行的。综合各方面因素，总结得到黄曲霉毒素测定仪的计量性能要求参考指标。该校准方法能够对该类测定仪的总体性能进行有效评判，为此类仪器的量值溯源提供技术支持与方法保证。