不同浓度白藜芦醇对破骨细胞分化的影响及自噬的作用

张倩 韩婕 汤旭磊

兰州大学第一医院内分泌科，甘肃 兰州 730000

破骨细胞是体内唯一具有骨吸收功能的细胞，其形成、分化和功能异常会造成骨吸收异常，骨代谢不平衡，骨吸收超过骨形成会造成骨质疏松等多种骨疾病[1-2]。天然的中草药提取物白藜芦醇是一类具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多种生物学活性的多酚类化合物，研究显示白藜芦醇对缺乏运动[3]、衰老[4]、卵巢切除[5-6]等多种因素引起的骨量丢失都具有骨保护作用。近年来白藜芦醇对破骨细胞的研究主要集中在炎症等条件下引起的骨量流失的现象和机制方面。在非炎症条件下，白藜芦醇对破骨细胞影响及机制的研究较少。有研究表明自噬参与破骨细胞形成、分化及骨吸收作用等多个阶段[7-9]，而白藜芦醇能够调节自噬，在不同的细胞中可以诱导自噬，也可以抑制自噬[10-11]。因此本实验主要研究不同浓度白藜芦醇对破骨细胞分化的影响及自噬在其中的作用，探讨白藜芦醇影响破骨细胞分化可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1材料

小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞株购自美国ATCC；高糖DMEM培养液(美国HyClone)；胎牛血清、双抗溶液(四季青)；核因子κВ受体活化因子配体RANKL(美国PeproTech)；TRAP染色试剂盒、白藜芦醇(美国Sigma)；3-MA(美国Selleck Chemicals)；RT-PCR 试剂盒、DNA Marker(TaKaRa 生物技术公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组：小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞用含10%胎牛血清，1%双抗溶液的高糖DMEM完全培养基培养于5 %CO2，37 ℃培养箱中。细胞分组Ⅰ：不处理组、RANKL+不同浓度RSV(0、0.1、0.5、1、5及10 μmol/L)组；细胞分组Ⅱ：RANKL+不同浓度RSV(0、0.5、10 μmol/L)组、3-MA+ RANKL+不同浓度RSV(0、0.5、10 μmol/L)组。RANKL诱导浓度为50 ng/mL。3-MA干预浓度和干预时间为10 mmol/L预刺激1 h，在白藜芦醇干预之前加入。

1.2.2细胞活力检测：RAW264.7细胞按每孔5×103个细胞的密度接种于96孔培养板，贴壁后按细胞分组Ⅰ处理，分别培养12、24、48、72 h弃上清，加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养2 h在酶标仪上测定各孔在450 nm处的吸光度。

1.2.3TRAP染色：RAW264.7细胞按每孔104个细胞的密度接种于24孔培养板，贴壁后按细胞分组Ⅰ处理，培养第5天固定液固定细胞，去离子水清洗后TRAP染色试剂盒进行染色。经过初染、洗涤、复染、洗涤、晾干等程序后显微镜观察形态并拍照。各组破骨细胞数比值通过Image-Pro Plus软件对TRAP染色阳性区域进行分析，计算染色区域的百分比。

1.2.4RT-PCR检测mRNA表达情况：RAW264.7细胞按每孔105个细胞的密度接种于6孔培养板，贴壁后按细胞分组Ⅰ和Ⅱ处理，培养第3天提取RNA，反转录后扩增。引物序列如表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primers of target genes

1.2.5Western blot检测自噬相关蛋白的表达情况：细胞培养及分组同1.2.4，第3天提取蛋白，定量后加入蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min。上样后进行电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。放入稀释好的一抗中Beta Actin(1∶3 000稀释)，LC3A/B(1∶1 000稀释)，P62(1∶1 000稀释)，Becline-1(1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次，放入稀释好的二抗中(1∶5 000稀释)，室温孵育1 h。TBST清洗3次，将ECL发光液均匀加在膜上，曝光并拍照。采用Image J图像分析软件，计算各条带的灰度值，结果以目的蛋白与内参蛋白灰度值之比表示。

1.3统计学处理

实验结果均以均数±标准差表示，采用SPSS 24.0软件进行统计分析。应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行多组间比较，方差齐性时，组间多重比较应用Fisher Least Significant Difference(LSD)；方差不齐时，应用Dunnett’s T3方法进行组间多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1白藜芦醇对细胞活力的影响

如表1和图1所示：与不处理组相比，加入50 ng/mL诱导剂RANKL均能促进RAW264.7细胞的增殖(P<0.05)；同时加入0.1～10 μmol/L白藜芦醇时，细胞增殖活力先上升后下降，在0.5 μmol/L时达到最大。

2.2白藜芦醇对破骨细胞分化的影响

如图2所示：RAW264.7细胞在50 ng/mL的RANKL诱导下生成大量TRAP染色阳性破骨细胞。当加入0.1 μmol/L和0.5 μmol/L白藜芦醇时，TRAP染色阳性破骨细胞数量增多；随白藜芦醇浓度增加，破骨细胞数量减少，白藜芦醇浓度为10 μmol/L时抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化。

表2 白藜芦醇对细胞活力的影响Table 2 The effect of resveratrol on cell

注：与不处理组比较，*P<0.05，与RANKL组比较，#P<0.05。

图1 白藜芦醇对细胞活力影响注：与不处理组比较，*P<0.05，与RANKL组比较，#P<0.05。Fig.1 The effect of resveratrol on cell viability

图2 不同浓度白藜芦醇对破骨细胞分化的影响注：与RANKL组相比，*P<0.05。Fig.2 Effects of different concentrations of resveratrol on osteoclast differentiation

2.3不同浓度白藜芦醇对破骨及自噬相关标志物mRNA表达的影响

如图3所示：RAW264.7细胞加入RANKL后破骨分化相关标志物CTSK、MMP9、TRAP及自噬相关标记物LC3、P62、Beclin-1的mRNA表达增加。加入不同浓度白藜芦醇干预，浓度在0.1 μmol/L和0.5 μmol/L时破骨分化相关标志物及自噬相关标记物mRNA表达增加；在1、5、10 μmol/L时随浓度增加，其mRNA的表达随之降低。

图3 不同浓度白藜芦醇对RANKL诱导下破骨及自噬相关标志物mRNA 表达水平的影响注：与不处理组比较，*P<0.05，与RANKL组比较，#P<0.05。Fig.3 Effects of different concentrations of resveratrol on mRNA expression levels of osteoclast and autophagy related markers induced by RANKL

图4 不同浓度白藜芦醇对自噬相关蛋白表达的影响注：与不处理组比较，*P<0.05，与RANKL组比较，#P<0.05。Fig.4 Effects of resveratrol at different concentrations on the expression of autophagy related proteins

图5 抑制自噬对破骨及自噬相关标记物mRNA表达的影响注：*P<0.05。Fig.5 Inhibition of autophagy on mRNA expression levels of osteoclast and autophagy related markers

2.4不同浓度白藜芦醇对自噬相关蛋白表达的影响

如图4所示：RAW264.7细胞加入RANKL后自噬相关蛋白LC3II/I和Beclin-1的表达增加，P62的表达减少。LC3II/LC3I增加同时P62减少说明自噬活性增强。加入0.1 μmol/L和0.5 μmol/L白藜芦醇时促进自噬；随白藜芦醇浓度升高则抑制自噬活性。

2.5抑制自噬对破骨及自噬相关标记物mRNA表达的影响

加入3-MA，RANKL诱导分化过程中破骨分化相关标志物CTSK、MMP9、TRAP和自噬相关标志物LC3、P62、Beclin-1的mRNA表达减少；0.5 μmol/L白藜芦醇干预后CTSK、MMP9、TRAP、 LC3、P62和Beclin-1的mRNA表达增加，加入3-MA后可抑制其表达；10 μmol/L白藜芦醇和3-MA抑制其相关标志物mRNA表达。

2.6抑制自噬对自噬相关蛋白表达的影响

如图6所示：加入3-MA后，自噬相关蛋白LC3II/I比值和Beclin-1的表达下降，蛋白P62的含量增加。3-MA可以完全抑制0.5 μmol/L白藜芦醇对自噬的促进作用；10 μmol/L白藜芦醇能抑制自噬，加入3-MA则进一步抑制自噬。

3 讨论

破骨细胞来源于单核/巨噬细胞系，是由单核前体细胞融合形成TRAP阳性的多核巨细胞。RAW264.7细胞是小鼠源性破骨前体细胞，RANKL诱导其产生破骨细胞是一种公认的比较成熟的体外培养破骨细胞的方法，具有均一性好，获得破骨细胞数多，没有其他分离、纯化等方法产生的如成骨细胞等杂质细胞，更有利于针对破骨细胞研究的开展[12]。

本实验中显示0.1、0.5 μmol/L的RSV干预后TRAP染色阳性破骨细胞增多，而1、5和10 μmol/L RSV的TRAP染色阳性破骨细胞则逐渐减少，RT-PCR进一步证实了破骨分化相关标志物CTSK、MMP9、TRAP的mRNA表达水平呈相应变化。之前也有研究表明RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中加入1～10 μmol/L的白藜芦醇，随白藜芦醇浓度增加TRAP染色阳性破骨细胞数目和组织蛋白酶K的表达逐渐降低；且其图示结果显示在0.3 μmol/L白藜芦醇干预后TRAP染色阳性破骨细胞数目有轻微升高[13]。但也有研究显示M-CSF和RANKL诱导小鼠骨髓提取的前体细胞向破骨细胞分化过程中，加入用虎杖饮片粉提取的白藜芦醇0.1 μmol/L和1 μmol/L干预后TRAP染色阳性破骨细胞数目减少[14]。与本研究结果相反，可能是由于白藜芦醇为其自行提取，药物纯度、分离技术和用于诱导破骨细胞分化的前体细胞不同所致。近年来的研究显示白藜芦醇干预直接抑制破骨细胞的分化，但干预浓度多在1～10 μmol/L之间。本研究显示更低浓度的白藜芦醇可以促进破骨细胞的分化，对白藜芦醇只抑制破骨细胞分化有了新的认识。

本研究观察到0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的白藜芦醇促进破骨细胞的分化的同时，自噬水平逐渐增高；随白藜芦醇浓度升高破骨细胞分化和自噬水平下降。提示白藜芦醇可能是通过调节自噬影响破骨细胞的分化。为进一步验证白藜芦醇对自噬的影响，选取0.5 μmol/L和10 μmol/L白藜芦醇加入自噬抑制剂3-MA，显示抑制自噬水平可以抑制0.5 μmol/L白藜芦醇对破骨细胞分化的促进作用；且抑制自噬可以进一步抑制10 μmol/L白藜芦醇对破骨细胞的分化。说明白藜芦醇可能是通过调节自噬影响破骨细胞的分化。有研究显示白藜芦醇能上调Sirt1的表达水平，进而上调FoxO1蛋白表达抑制破骨细胞的分化[15]。也有研究显示RSV降低TRAP染色阳性破骨细胞数并抑制细胞内ROS生成，表明RSV对破骨细胞分化的抑制作用是通过清除ROS介导的[13]。由此可见白藜芦醇通过调节Sirt1、ROS和FoxO1等多种信号通路调节破骨细胞的形成。而研究表明Sirt1、ROS和FoxO等与自噬之间相互作用形成复杂的信号网络，Sirt1可以通过对自噬基因Atg5、Atg7、Atg8等自噬诱导网络的关键成分的去乙酰化直接影响自噬，细胞核定位的Sirt1还可以通过激活FoxO转录因子家族成员来诱导自噬通路组分的表达，乙酰化的FoxO1可以在细胞质中与Atg7结合并直接影响自噬。ROS的相对过量积累导致氧化应激可以促进自噬的形成，自噬通过吞噬和降解氧化物质，进而降低氧化损伤，自噬也可以通过伴侣介导的自噬、有丝分裂、P62传递等多种途径调节ROS水平[16-17]。因此白藜芦醇可能通过调节Sirt1、ROS、FoxO影响自噬从而影响破骨细胞的分化，其相互作用和分子调控机制还有待进一步研究。

综上所述，RANKL诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化过程中，白藜芦醇浓度在0.1～10 μmol/L范围内，破骨细胞分化和自噬水平先升高后降低，抑制自噬可以抑制破骨细胞的分化。白藜芦醇影响破骨细胞分化可能部分是通过调节自噬发挥作用，有望为白藜芦醇治疗骨质疏松提供新的作用靶点，但其具体的作用机制还有待进一步的研究。