基于生物信息学探讨骨质疏松症与2型糖尿病的关系

冯蓬 陈德强

山东中医药大学，山东 济南 250355

骨质疏松症(OP)是一种以骨量低下、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性疾病。2型糖尿病的主要病理生理学特征为胰岛素调控葡萄糖代谢能力的下降(胰岛素抵抗)伴随胰岛 β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少(或相对减少)。近年来国内外多项研究发现，2型糖尿病不仅仅可以导致全身多系统血管损害，也同样会对骨代谢产生影响，并表现在骨折风险增加[1]。随人口老龄化，人们生活方式的改变，骨质疏松症合并2型糖尿病的发病率居高不下，王玉楠等[2]研究发现2型糖尿病合并骨质疏松症高达69.6%。骨质疏松症与2型糖尿病均是严重影响人们生活质量，给个人和国家带来沉重经济负担的疾病。

骨质疏松症与2型糖尿病原本是两种相互独立的疾病，但随着临床资料的积累，两种疾病间的相互作用关系被逐渐发现，越来越多的基础与临床研究投入其中。但2型糖尿病与骨质疏松症的关系始终不明确，两种疾病同时存在骨折风险增加的事实不能够被骨密度检测结果所解释[3]。这需要更加深入的剖析两者的发病机制，骨质疏松症与2型糖尿病同属于代谢性疾病，两者的基因易感性存在相互联系，如含卷曲结构域的蛋白170(CCDC170)/雌激素受体基因1(ESR1)基因在骨质疏松症与2型糖尿病中均存在密切联系[4]，试图从分子生物学角度构建两者相互关系。

随着生物信息学与计算机技术的飞速发展，诸多疾病数据库的建立与完善，为我们提供一条在分子水平系统认识复杂疾病相互关系的途径。骨质疏松症与2型糖尿病关系极为复杂，二者是涉及多器官、多系统、多靶点的全身代谢性疾病，并且涉及多基因、多通路调控。因此，将多组基因数据整合分析，探讨骨质疏松症与2型糖尿病的分子机制相互关系具有重要意义，并为药物同时干预两种疾病提供理论基础。

1 材料和方法

1.1方法

检索五大国际公认的疾病数据库以及挖掘Pubmed文献数据库获得骨质疏松症与2型糖尿病相关靶点，其中包括Disgenet数据库[5]、TTD数据库[6]、OMIM数据库[7]、Drugbank数据库[8]、KEGG数据库[9]，分别以“osteoporosis”、“type 2 Diabetes”为关键词进行检索与筛选。在Disgenet数据库(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)中以关键词进行检索获得相关疾病基因；在TTD数据库中(https://db.idrblab.org/ttd/)剔除已中断研究的药物作用于疾病的靶点，仅保留药物处于临床试验或已经成功的基因靶点；在OMIM数据库(http://www.omim.org/)中仅选用以*号作为标识的基因作为候选靶点；在Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)，为了提高准确性，仅选用经食品药品管理局(FDA)批准且为人类基因/蛋白的药物所对应的靶点；在KEGG数据库(http://www.kegg.jp/)中以疾病名称进行检索，分别获得其药物作用于疾病的靶点。随后，将获得两组疾病的基因/蛋白数据相互映射交集。最后，通过查阅相关文献以确认所获得靶点的准确性，最后将所获得靶点筛选、去重。

1.2DAVID数据库

DAVID数据库[10-11](https://david.ncifcrf.gov/)可用于基因富集分析及信息的可视化，利用DAVID数据库，将上述两组疾病靶点分别进行基因富集分析以及KEGG通路分析。将两组疾病相关靶点相互映射并将所获得的交集靶点导入DAVID数据库进行基因富集分析以及KEGG通路分析。最后，利用Cytoscape[12]软件构建两种疾病相互交互的通路。

2 结果

2.1以“osteoporosis”为关键词对五大国际公认的数据库进行检索，获得与骨质疏松症相关的疾病基因/蛋白，其中DISGENET数据库10个、TTD数据库12个、OMIM数据库55个、DRUGBANK数据库35、KEGG数据库6个，以及通过PUBMED文献数据库获得的基因/蛋白218个，共计336个。“type 2 Diabetes”为检索关键词对五大常用数据库进行检索，以获得与2型糖尿病相关靶点，其中DISGENET数据库33个、TTD数据库38个、OMIM数据库198个、DRUGBANK数据库45，共计314个。随后，将两组疾病相关基因/蛋白相互映射，获得相交的基因/蛋白46个(表1)。最后，将所获得靶点导入PUBMED数据库以验证其准确性。

2.2将基因/蛋白信息分别导DAVID数据库，物种仅选用“Homo sapiens”，分别分析获得疾病基因/蛋白信息所富集的通路，并将基因信息可视化。将所获得基因/蛋白富集通路整理成表格，利用Cytoscape构建两种疾病交互通路图，获得图1及图2。

表1骨质疏松症与2型糖尿病数据库中重叠的差异基因 46个

Table1There were 46 overlapping differentially expressed genes in the osteoporosis and type 2 diabetes databases

TNFHSD11B1IL1RNFTO VEGFABTKSERPINA12SIRT1SOD2FGF21RHOANOS3LEPRATF6IL10PON1IGF1MTNR1BEIF2AK3CCL2IRS2NPYHPVDRTGFB1DPP4P2RX7IL4IL6CALCRIL17 AHLA-ALEPAPOEIGF1RPTGS2HLA-DQA1ACELMNAIL1BHLA-DQB1ALBIL1ACNR1ADIPOQSERPINE1

图1 骨质疏松症与2型糖尿病通过DAVID数据库基因富集结果Fig.1 The gene enrichment results of osteoporosis and type 2 diabetes were obtained from the DAVID database

3 讨论

基于生物信息学以及计算机技术，通过检索疾病相关数据库，将获得的基因通过文献加以验证，分别将获得的基因导入DAVID数据库，实现基因富集分析以及KEGG通路分析，使基因信息可视化。从表中可以看出，骨质疏松症主要涉及PI3K-AKT信号通路、Rap1信号通路、TNF 信号通路、MAPK信号通路、甲状腺素信号通路、Ras 信号通路、FoxO 信号通路、NF-κB信号通路、Wnt信号通路等。在这些通路中，一些通路被广泛研究。如NF-κB信号通路中，在ⅠκB激酶(IKK)复合体激活后，ⅠκB泛素磷酸化降解，NF-κB游离并转移至细胞核内，作为转录因子调节破骨细胞分化、活性及凋亡[13]。如Wnt信号通路中，下游蛋白复合物因存在Wnt信号刺激而不发生磷酸泛素化降解而积聚在细胞核内，进而启动靶基因如c-myc、cyclinD1的转录，促进细胞增殖[14]。2型糖尿病涉及的通路包括PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、胰岛素信号转导通路、脂肪细胞因子信号通路、FoxO信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、胰高血糖素信号通路、Ras信号通路等。许多研究亦建立在这些通路中，如徐寒松等[15]认为，黄芪多糖能够通过激活PI3K/AKt/eNOS信号通路促进2型糖尿病患者内皮祖细胞增值和向内皮细胞的分化。刘雪芹等[16]在研究中发现，虫草多糖可增强胰岛素信号通路敏感性，改善葡萄糖代谢，从而缓解糖尿病小鼠胰岛素抵抗及高血糖症状。

图2 利用Cytoscape 构建骨质疏松症与2型糖尿病存在相互交互的通路(图中Signaling pathway已被省略)Fig.2 Cytoscape was used to construct the interactive pathways between osteoporosis and type 2 diabetes

在骨质疏松症与2型糖尿病相关联的通路表中，我们看到大量通路是重叠的，这表明骨质疏松症与2型糖尿病关系密切，存在着广泛的相互作用关系，这些通路包括PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、Jak-STAT信号通路、Ras信号通路、NF-kappa B信号通路、T细胞信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、脂肪细胞因子信号通路、fc-εri信号通路。在PI3K/Akt通路中，王秉义等[17]研究发现PI3K/Akt通路在丹参素拮抗成骨细胞的凋亡过程中起到关键作用，能够上调pAkt表达，且BAX、AIF、cyto-C等与细胞凋亡相关蛋白表达降低。在刘美晓等[18]的研究中发现，丝胶能够上调PI3K以及Akt表达，改善糖尿病状态下PI3K/Akt通路的异常，发挥降血糖作用；在NF-κB信号通路中，吴昆鹏等[19]通过研究发现，经典的和旁路的NF-κB信号通路影响细胞、破骨细胞增殖、分化，NF-κB的高表达使破骨细胞增多、骨吸收增强、骨形成减少。研究[20]表明，NF-κB的激活也许是导致β细胞功能异常的关键媒介，同时亦可能是糖尿病血管病变发生发展的始动因素之一；在Jak-STAT 信号通路中，谢丽华等[21]研究发现，六味地黄丸在治疗肾阴虚证骨质疏松症中差异表达基因有25条，上调11条，下调14条，其中JUN、JUNB治疗后明显上调。苏静等[22]研究发现，在白芍总苷治疗糖尿病大鼠过程中，肾组织Jak-STAT 信号通路中TGF-β1蛋白表达明显增高；杨亚军等[23-24]研究发现，某些药物能够通过FOX通路保护氧化损伤的成骨细胞来调节骨质疏松症；黄荷等[25]通过研究发现，FOX是胰岛素信号通路的下游关键分子，受上游PI3K/AKT信号磷酸化调节，与胰岛β细胞的细胞周期、细胞凋亡、衰老及代谢有着密切关系。因此，在诸多信号通路中，骨质疏松症与2型糖尿病相互影响、相互作用，有着密不可分的关系。

2型糖尿病与骨质疏松症的相互影响是多途径的、综合的，高糖环境、胰岛素、糖基化产物、降糖药物等都可以对骨代谢产生影响，是一个复杂的全身性过程[26]。研究[27]表明，高糖环境可以改变成骨细胞的生物矿化过程，可以增加RANKL、骨钙素、BSP和Cbfa，并降低OPG表达，高葡萄糖可增加IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1和IL10mRNA的表达，增加矿物质的数量，降低矿物质的质量。不同浓度的葡萄糖对成骨细胞作用存在差异，有研究[28]发现，当葡萄糖浓度逐渐升高时，其诱导成骨细胞凋亡作用更加明显，提示高糖对成骨细胞有毒性作用。高糖环境不仅仅对成骨细胞存在影响，对破骨细胞亦存在影响，Williams等[29]发现，破骨细胞存在葡萄糖浓度依赖性，在7～25 mmol/L的葡萄糖浓度能够维持最大化的骨吸收活动。因此，调控血糖与抗骨质疏松治疗是治疗2型糖尿病骨质疏松症的基础环节，但血糖的控制并不能因此改变糖尿病对骨代谢的影响，内在的分子机制仍然对骨代谢产生重要影响。反观目前治疗2型糖尿病的药物，有些药物如噻唑烷二酮类药物、磺脲类药物等甚至可以增加骨量丢失与骨折风险[30-32]，这有可能会对高血糖并发症的控制和抗骨质疏松症的治疗带来不利影响。在能够同时调控2型糖尿病与骨质疏松症的通路中寻找共同的作用靶点，使得药物能够从基因水平调控糖代谢、骨代谢，是较为理想的治疗2型糖尿病骨质疏松症的药物。而根据基因富集结果的对比，2型糖尿病骨质疏松症的疾病机制以PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、AMPK信号通路、Rap1信号通路、Jak-STAT信号通路、Ras信号通路、NF-kappa B信号通路、T细胞信号通路、TNF信号通路、VEGF信号通路、脂肪细胞因子信号通路、fc-εri信号通路等信号通路为主，同时针对以上这些通路的药物亦有可能同时对骨代谢与糖代谢同时产生双向调控作用，但这需要进一步实验的验证。

骨质疏松症与2型糖尿病均存在庞大的疾病基因网络，但这些网络并不是孤立存在的，而是存在密不可分的联系。通过相关平台获得的两种疾病网络相交叉的部分正是两种疾病相关联的部分，也是研究骨质疏松症与2型糖尿病相互关系的突破点，同时可以为药物同时干预两种相互关联的疾病提供可能的靶点。当然，对差异表达的基因信息进行整合处理依赖于生物信息学与计算机技术的发展，疾病数据库的完整性、准确性直接决定着整合后信息的可靠性。本研究在运用生物信息相关数据进行分析时并未将基因的表达量和对相关靶点的激活程度一并考虑在内，这需要对生物信息学以及疾病数据库更进一步的完善与发展，研究结果仍需要后续进一步实验验证与支持，使理论更加可靠。