基于网络药理学探讨骨碎补治疗骨质疏松症的作用机制

马江涛 万雷 黄宏兴*

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405 2. 广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510375

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种全身性骨骼疾病，其特点是骨量降低，骨组织微结构破坏，从而导致骨脆性增加，骨折风险增加。随着人口老龄化以及糖皮质激素的广泛应用，骨质疏松症在很大程度上已成为“隐形杀手”。预计到2050年[1]，全世界60岁及以上的老年人数将达到20亿。到那时，骨质疏松症的发病率也会迅猛增加，这将成为沉重的社会经济负担。目前，OP的治疗[2]主要包括补充骨健康基本补充剂(钙剂、维生素D)，骨吸收抑制剂(双膦酸盐、降钙素、雌激素、选择性雌激素受体调节剂等)，骨形成促进剂(甲状旁腺素类似物)，活性维生素D及其类似物等。但这些西药普遍存在不良反应众多、价格高昂等问题，这严重限制了西药在临床上的广泛应用。因此，迫切需要寻求高效、安全、价廉的抗骨质疏松新药。

近年来，多项研究[3]表明中药影响骨质疏松症的骨代谢，调节人体骨代谢相关细胞因子及信号通路，促进成骨细胞合成，抑制骨量丢失，明显改善患者骨质疏松症状。其中，补肾助阳、活血化瘀类中药，如淫羊藿、杜仲、续断、补骨脂、骨碎补等，对骨质疏松症的治疗效果显著。骨碎补[4]，为槲蕨的干燥根茎，性温、味苦，归肝、肾经，具有活血止痛，补肾强骨的功效，能通血脉、续筋骨、疗伤痛，为伤科要药。本品含柚皮苷、骨碎补双氢黄酮苷、骨碎补酸等成分，能促进对钙的吸收，提高血钙和血磷水平，有利于骨钙化和骨质的形成。除了抗骨质疏松的作用外，骨碎补具有不良反应少，价格低廉等优点。因此，研究骨碎补中有效成分治疗骨质疏松症的作用机制具有重要的理论价值。

网络药理学是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定的信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科。中药网络药理学基于多学科交叉，整合中药、中药有效成分、中药靶标、疾病靶标、信号通路等信息，利用靶标的一致性进行大数据分析，得出中药-疾病靶标并进行相关通路分析，这为科学研究中药复方的作用机制提供了技术支持，也为中医药研究的现代化指明了方向。因此，本研究基于中药网络药理学的相关原理及软件，探索并构建单味中药骨碎补治疗OP的作用机制网络，为进一步研究骨碎补的作用机制及新药开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1资料

本研究使用的数据库及相关分析平台见表1。

1.2方法

1.2.1骨碎补中有效成分的筛选和靶点预测

本研究通过检索中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，对骨碎补的所有有效成分进行初步筛选，其中筛选条件[5]为口服生物利用度(oral bioavailability, OB)>30%，药物类药性(drug likeness，DL)>0.18，见表2。采用TCMSP靶点预测模型和Perl软件对相关有效成分作用靶点进行预测。

1.2.2骨碎补靶点基因名(gene symbol)的添加

利用Perl软件和UniProt知识库为筛选出的靶点基因添加基因名，由于某些靶点可能在UniProt知识库中找不到对应的基因名，无法找到基因名的靶点删除，故实际得到的靶点基因名要少。

1.2.3已知OP相关疾病靶点基因的获取

利用“osteoporosis”作为关键词，对GeneCards数据库、OMIM数据库进行已知疾病靶点基因的检索及筛选，并删除检索结果中重复的靶点基因，得到疾病靶点基因。

1.2.4中药靶点基因和疾病靶点基因的交集

利用R语言软件将疾病靶点基因与中药靶点基因取交集，得到中药-疾病共同靶点基因的韦恩图(见图1)，从中得到中药-疾病共同靶点基因。

1.2.5中药-疾病调控网络的构建

将中药靶点基因和中药-疾病共同靶点基因利用Perl软件进行一一映射，然后利用Cytoscape软件进行计算，得到中药-疾病调控网络(见图2)。其中节点的类型有疾病、中药、中药靶点基因和中药-疾病共同靶点基因。

1.2.6骨碎补治疗OP的靶点基因蛋白相互作用网络构建与核心靶点基因的筛选

利用STRING在线软件将中药-疾病共同靶点基因输入软件，筛选条件为种属选择人，最小互作分数值为0.7，保存相应结果文件(见图3)。将所得文件输入R语言计算，得到蛋白互作网络核心基因的条图(见图4)。

1.2.7GO和KEGG功能富集分析

将中药-疾病共同靶点基因利用R语言软件计算，得到GO功能富集分析(图5a、5b)和KEGG功能富集分析(图6a、6b)。以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1骨碎补有效成分及相关靶点筛选

通过对TCMSP数据库中骨碎补所有已报道的有效成分及其相关靶点筛选，共搜索到有效成分71个，相关靶点587个。根据OB和DL参数对骨碎补的有效成分进行筛选，共获得有效成分18个，有效成分对应的靶点304个。

表1 本研究使用的数据库及相关分析平台 Table 1 Databases and related analysis platforms used in this study

表2 通过TCMSP数据库骨碎补所有成分根据OB和DL参数进行筛选后的结果Table 2 The results of screening all ingredients of Rhizoma Drynariae by OB and DL parameters in TCMSP database

2.2中药靶点基因和疾病靶点基因的交集

利用R语言软件将疾病靶点基因与中药靶点基因取交集，得到中药-疾病共同靶点基因的韦恩图，从中得到中药-疾病共同靶点基因98个。其中疾病靶点基因3 530个，中药靶点基因148个。

图1 中药靶点基因和疾病靶点基因的交集Fig.1 The intersection of TCM target genes and disease target genes

2.3中药-疾病调控网络的构建

图中红色代表(菱形)骨质疏松症，蓝色(椭圆形)代表中药骨碎补，绿色(箭头形)代表骨碎补的有效成分，黄色(三角形)代表中药-疾病共同靶点基因。中药骨碎补主要通过10种有效成分作用于98个靶点基因，这98个靶点基因可能影响骨质疏松症的发生。

图2 中药-疾病-靶标调控网络Fig.2 The regulatory network of TCM-Disease-Target

2.4骨碎补治疗OP的靶点基因蛋白相互作用网络构建与核心靶点基因的筛选

根据文献研究，筛选出骨碎补治疗OP的核心靶点基因。其中，邻接节点较多的4个靶标分别是：白介素-6基因(IL-6)、JUN基因、丝裂原活化蛋白激酶-1基因(MAPK-1)、表皮细胞生长因子基因(EGF)。

IL-6[6]是骨吸收的重要环节，其以自分泌和旁分泌形式作用于成骨细胞，促进自身合成，调节bax/bcl-2比值，抑制破骨细胞凋亡，促进成骨细胞凋亡，导致骨质疏松症。原发性骨质疏松时骨组织中癌基因c-JUN表达增加，c-JUN表达增加与骨细胞和成骨细胞凋亡有关，c-JUN与原发性骨质疏松症存在联系[7]。MAPK是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，MAPK-1是MAPK的一个亚型，许多胞外信号通过MAPK信号通路，参与成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化和凋亡，在骨质疏松的发生中具有重要作用[8]。体外实验表明EGF促进破骨细胞骨吸收，抑制成骨细胞骨形成，参与骨质疏松[9]。

图3 骨碎补治疗OP的靶点基因蛋白互作网络Fig.3 Target gene protein protein interaction (PPI) network of Rhizoma Drynariae for OP

图4 蛋白互作网络核心基因的条图Fig.4 Barplot of PPI core genes注：左列为基因名，如IL-6(interleukin-6，白介素-6)，数字为相应基因邻接节点数目，如IL-6邻接节点数目为41。

2.5GO功能富集分析

骨碎补治疗OP的核心靶点基因的GO功能富集分析结果见图5a、5b。骨碎补治疗OP的核心靶点基因的GO功能主要涉及血红素结合、辅因子结合、细胞因子受体结合、四吡咯结合、类固醇激素受体活性、核受体活性、转录因子活性、细胞因子活性、氧化还原酶活性、转录激活活性、受体配体活性等。

图5a GO功能富集分析柱状图Fig.5a GO functional enrichment analysis barplot

图5b GO功能富集分析气泡图Fig.5b GO functional enrichment analysis dotplot注：柱状图图形左侧字母为GO名称，下面数字为基因的数目，柱状图形表示富集在GO上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。

气泡图图形左侧字母为GO名称，下面数字为基因的比例，圆圈大小表示富集的基因的数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。

2.6KEGG通路富集分析

骨碎补治疗OP的核心靶点基因的KEGG通路富集分析结果见图6a、6b，骨碎补治疗OP的核心靶点基因的KEGG功能主要涉及：糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化信号通路等。富集程度相对低的信号通路有：NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、凋亡信号通路、MAPK信号通路、破骨细胞分化信号通路、T细胞受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、FoxO信号通路等。

图6a KEGG功能富集分析柱状图Fig.6a KEGG functional enrichment analysis barplot

图6b KEGG功能富集分析气泡图注：柱状图图形左侧字母为KEGG名称，下面数字为基因的数目，柱状图形表示富集在KEGG上的基因，P代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。Fig.6b KEGG functional enrichment analysis dotplot

综合有关骨质疏松信号通路的文献，研究发现糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化信号通路、NF-κB信号通路、凋亡信号通路、MAPK信号通路、破骨细胞分化信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、FoxO信号通路等均参与骨质疏松的发病。

气泡图图形左侧字母为KEGG名称，下面数字为基因的比例，圆圈大小表示富集的基因的数目，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。

3 讨论

基于中医药“整体观念”和网络药理学“系统生物学”的理论，中药网络药理学通过TCMSP分析平台等软件，构建“中药-有效成分-靶标-疾病”网络，全面分析整合中药多种有效成分作用于疾病的靶标，深入研究中药-疾病核心靶标的作用机制，为研究中药的作用机制及中药新药开发提供技术和理论支持。

本研究表明，骨碎补的主要有效成分可通过多个靶点基因、多个信号通路影响OP的发生。骨碎补治疗OP的核心靶点基因主要有IL-6基因、JUN基因、MAPK-1基因、EGF基因等，这些基因可通过介导骨吸收和骨形成来调控骨质疏松的发生。骨碎补治疗OP的核心靶点基因的KEGG通路众多，这些通路主要包括糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化信号通路等。柳辰玥[10]研究发现桑叶水提液可能通过抑制糖尿病性骨质疏松症患者股骨和胫骨中AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信号通路中相关蛋白的表达，减轻氧化应激损伤来防治糖尿病性骨质疏松。陈鹏等[11]发现绝经后骨质疏松症中TNF-α通过激活NF-κB来促进RANKL诱导的破骨细胞形成。张国权等[12]通过体外培养大鼠成骨细胞，发现IL-17通过上调cathepsin K、MMP9的表达量，从而增强破骨细胞降解骨基质的能力。钟航等[13]通过动物实验发现HIF-1信号通路参与了小鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)的病理演变过程，抑制HIF-1信号通路可改善PMOP的严重程度。李春亮等[14]通过临床研究发现骨质疏松合并压缩性骨折患者Th17细胞功能的增强能够影响骨代谢过程中的炎性反应及蛋白酶活性。这些富集度高的信号通路主要通过减轻氧化应激损伤、抑制破骨细胞形成、促进成骨细胞形成等作用发挥抗骨质疏松作用。骨碎补可能通过抑制糖尿病并发症患者骨骼的AGE-RAGE信号通路中相关蛋白的表达，减轻氧化应激损伤来防治糖尿病性骨质疏松；可能通过TNF-α激活NF-κB来促进RANKL诱导的破骨细胞形成；可能通过IL-17上调cathepsin K、MMP9的表达量，从而增强破骨细胞降解骨基质的能力；可能通过抑制HIF-1信号通路改善PMOP的严重程度。

综上所述，骨碎补治疗OP的作用机制是通过骨碎补中多种活性成分调控OP相关的靶点基因，靶点基因进一步调控多种信号通路，最终在多种信号通路的综合作用下，机体表现出相应的表型。这为发现新通路，调控富集程度高的信号通路来治疗疾病以及全面认识中药与疾病的关系提供了思路。中药网络药理学开启了探索中药复方治疗疾病作用机制的大门，必将促进中药的现代化研究。