慢性肾衰患者褪黑素水平、氧化应激、炎症水平与骨密度相关性研究

徐志平 闻纯 王丽

1.江苏医药职业学院基础教研室，江苏 盐城 224005 2.宁夏医科大学总医院肾脏内科，宁夏 银川 750004

骨质疏松(OP)是全身骨骼系统的一种临床常见病，以骨组织的微结构损伤和低骨量为特征，患者易发生骨折[1]。慢性肾功能衰竭(CRF)的维持性血液透析(MHD)会出现感染、心血管疾病和OP等多种并发症。MHD患者OP发生率高达40%～60%，严重影响患者的生活质量[2]。MHD患者常有氧化应激(OS)和微炎症状态，晚期氧化蛋白产物(AOPP)是反映机体OS状态的指标之一，丙二醛(MDA)是OS的终末代谢产物，可作为反映机体OS水平的指标；炎症状态主要表现为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1(IL-1)水平的升高[3]。褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的一种激素，它不仅具有抗炎、抗氧化和调节睡眠的作用，而且通过多种途径促进成骨细胞的增殖和分化，抑制破骨细胞的增殖和分化，与OP密切相关[4]。本研究通过检测慢性肾功能衰竭患者血液中MT、AOPP、丙二醛、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1(IL-1)的水平，分析它们是否参与OP的发生及其与BMD的关系。

1 材料和方法

1.1一般材料

本研究纳入了2016年5月至2019年2月期间在我院长期接受MHD治疗的CRF患者94名。纳入标准：①符合慢性肾功能衰竭诊断标准的患者；②接受MHD超过3个月的患者；③签署知情同意书的患者。排除标准：①患有严重心脏、脑或肝脏疾病或伴有精神疾病的患者；②恶性肿瘤患者，孕妇或哺乳期妇女。根据是否涉及骨质疏松症，入选患者分为骨质疏松组(观察组，n=49)和非骨质疏松组(对照组，n=45)。两组间的基线数据差异无统计学意义(P> 0.05)(表1)。所有患者均使用血液透析机(Fresenius，Oberursel，德国)，将双腔导管置于颈部或右股静脉的右侧以建立心肺分流术；稀释置换液(上海长征药业有限公司，中国上海)使用负压超滤泵和低分子量肝素(天津大通药业有限公司，天津，中国，批准号NMPN H20020469)用于抗凝(第一剂量3 000U，加入500U/h，置换率4.0 L/h)，血流量保持在约200 mL/min。患者每次治疗4 h，每周接受3次透析。该研究得到了我院伦理委员会的批准，患者和/或监护人签署了书面知情同意书。

1.2指标检测

使用双能X射线骨密度计(深圳XRAY电气有限公司，中国深圳)测量腰椎(L1-L4)BMD，图形分析区域分为总腰椎区域；计算T值。OP的判断标准：①正常骨量：T值>-1；②骨量减少：T值=-1至-2.5；③OP：T值<-2.5。通过ELISA分析血清AOPP，炎症因子(TNF-α，IL-6和IL-1)和MT的水平，并通过TBA检测MDA水平。从患者收集静脉血5 mL(禁食8 h后的早晨7:00)，立即分离血清并置于-80 ℃冰箱中备用。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量血清AOPP、MT、TNF-α、IL-6和IL-1的水平。相关试剂盒由上海恒源生物科技有限公司(中国上海)提供，操作严格按照试剂盒的说明进行。将样品(1倍稀释)和100 μL酶标记的溶液加入到反应板的微孔中，在37 ℃下孵育90 min。将板洗涤3次(每两次间隔15 s)后，加入显色剂A和B(各50 μL)，在室温，20 ℃，黑暗中培养15 min。使用酶标仪(深圳SinoThinker Technology Co.，Ltd.，Shenzhen，China)在15 min内450 nm波长下读取OD值。然后计算AOPP、MT、TNF-α、IL-6和IL-1的水平。通过硫代巴比妥酸(TBA)测定法检测血清MDA。将MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京，中国)中的试剂A通过水浴加热至透明，加入340 mL双蒸水并均匀混合到试剂B中并在4 ℃下储存。在试剂C被60 mL双蒸水(95 ℃)完全溶解后，加入60 mL冰醋酸，混合均匀并在4 ℃下避光保存。将标准产物(10 nmol / mL四乙氧基丙烷)储存在4 ℃。操作步骤：①将标准品(1 mL)加入标准管中，将血清(0.1 mL)加入试管中，并将无水乙醇加入标准空白管中；②加入试剂A(0.1 mL)并均匀混合到标准管、标准空白试管和试管中，然后加入试剂B(0.1 mL)；③将试剂C(0.1 mL)加入标准管，试管和标准空白管中，并将50%冰醋酸(0.1 mL)加入试验空白管中；④使用旋流混合器将溶液均匀混合，用保鲜膜拧紧管口，刺穿一个冒口，然后将管浸入热水(95 ℃)中40 min并在流水下冷却；⑤以2 000×g离心10 min后，取上清液，用酶标仪测定波长532 nm的OD值，计算血清中MDA的水平。

1.3统计学处理

使用SPSS 19.0软件处理数据。测量数据以均数±标准差，并使用t检验；计量数据以比率表示，并使用卡方检验。Pearson的相关系数用于相关性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

两组患者氧化应激和MT水平的比较，如表2所示；观察组AOPP和MDA水平显著高于对照组，但MT水平显著低于对照组(P<0.05)。

两组患者炎症因子水平的比较，如表3所示；观察组TNF-α，IL-6和IL-1水平显著高于对照组(P<0.05)。

腰椎骨密度和T值比较，如表5所示。观察组中腰椎的BMD和T值均显著低于对照组(P<0.05)。

氧化应激，炎症和MT水平与BMD的相关性分析如图1所示，Pearson相关分析显示AOPP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1水平与BMD呈负相关，但MT与BMD呈正相关(P<0.05)。

表1 两组患者的基线数据Table 1 Baseline characteristics of patients in the two groups

表2两组患者氧化应激和MT水平的比较

Table2Comparisons of oxidative stress and MT level between the two groups of patients

组别nAOPP (μmol/L)MDA (nmol/L)MT(pg/mL)观察组对照组4945 108.95±15.1343.69±9.06 5.97±1.472.73±0.8619.76±3.3824.43±3.27t值P值25.091<0.00112.894 <0.001 6.797<0.001

表3两组患者炎症因子水平的比较(ng/L)

Table3Comparisons of inflammatory factor levels between the two groups of patients (ng/L)

组别nTNF- αIL-6IL-1观察组对照组49 45 49.98±3.15 37.83±3.04 53.48±3.35 41.45±3.23 47.28±3.1935.39±3.17t值P值18.996 <0.001 17.693 <0.001 18.106<0.001

表4腰椎骨密度(BMD)和T值的比较

Table4Comparisons of lumbar spine bone mineral density (BMD) and T-score

组别nBMD (g/cm2)T值观察组对照组4945 0.73±0.120.91±0.13-3.75±0.93-1.03±0.86t值P值 6.981 <0.001 14.683<0.001

3 讨论

OP是由骨代谢紊乱(骨吸收大于骨形成)引起的，其特征在于每单位体积的骨质量减少和骨脆性增加，并且它将持续发展并且容易导致骨折[5]。临床上，BMD通常用于OP诊断。骨骼系统中松质骨(60%～75%)集中在人体腰椎，因此MHD患者腰椎BMD的测量可以反映骨矿物质含量的早期变化。此外，松质骨的骨转换率高于皮质骨，对各种代谢刺激更敏感。此外，其骨量积累将比皮质骨更早达到峰值，因此腰椎BMD的测量具有更高的敏感性[6]。过去，人们认为CRF患者伴随OP的机制是患者体内钙磷代谢紊乱降低了体内维生素D的水平，从而导致代谢性酸中毒和继发性甲状旁腺功能亢进。近年来，随着研究的深入，人们已经认识到接受长期MHD的CRF患者的骨代谢将由多种激素和细胞因子共同调节，从而导致OPG/RANKL系统在体内的异常表达水平和功能障碍，最终影响破骨细胞的分化和功能并诱导OP[7]。 MT是松果体分泌的一种吲哚神经内分泌激素，也是目前已知的最强的自由基清除剂[8]。研究表明，CRF患者的MT分泌明显低于正常人群，尤其是夜间MT峰值消失的MHD患者[9]。人体正常状态下具有完善的抗氧化机制，它可以通过酶催化和无酶催化消除氧自由基，从而起到抗氧化作用[10]。当体内防御系统功能低下时，氧化还原反应将失去平衡，导致活性氧(ROS)的积累，氧化和抗氧化之间的不平衡，其中氧化占主导地位，导致OS[11]。AOPP是OS状态下白蛋白产生的一种双精氨酸蛋白质交联剂。MDA是一种有毒物质，由体内超氧阴离子对细胞膜中不饱和脂肪酸的过氧化作用产生[12]。

表5氧化应激，炎症和MT水平与BMD的相关性分析

Table5Correlation analysis of oxidative stress, inflammation and MT level with BMD

变量r值P值变量r值P值TNF-αIL-6 IL-1 -0.487-0.401-0.417 -0.401 -0.417 -0.406 AOPP MDA MT -0.406 -0.424 0.439 -0.424 0.439 0.015

图1 AOPP、MDA、TNF-α、IL-6、IL-1和MT水平与BMD的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of AOPP, MDA, TNF-α, IL-6, IL-1 and MT levels with BMD

本研究结果显示观察组MT水平显著低于对照组，但AOPP和MDA水平显著高于对照组(P<0.05)，表明CRF患者OP具有明显的氧化-抗氧化系统不平衡，因为AOPP不仅来自ROS，而且也是OS的结果。此外，MDA具有强烈的细胞毒性，会引起大分子(蛋白质、脂类和核酸)的交联聚合，其含量直接反映了脂质过氧化的速率和强度，可以作为指标。自由基损伤的严重程度，间接反映了氧自由基损伤的过程。降低的MT水平可能与OS有关，并且在CRF患者中与OP相互作用。CRF患者的蛋白尿和高肾素-血管紧张素活性可刺激机体的炎症反应，并抑制T淋巴细胞免疫功能并导致免疫功能障碍[13]。TNF-α是一种重要的单核炎症因子，IL-6是白细胞介素家族的一员，也是急性期反应中的淋巴细胞因子，在免疫反应中发挥多种作用[14]。此外，IL-1也是白细胞介素家族的重要成员之一，包括IL-1α和IL-1β，其中IL-1β是炎症过程中重要的炎性细胞因子之一[15]。本研究结果显示，观察组TNF-α、IL-6和IL-1水平明显高于对照组(P<0.05)，提示CRF患者的微炎症更为明显。

本研究结果显示，AOPP、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1水平与BMD呈负相关，但MT与BMD呈正相关(P<0.05)，因为足够的MT会减少形成和激活骨痂，从而抑制骨吸收并增加骨量[16]。此外，MT可诱导生长激素的分泌，其协同应用可促进新骨的形成。但随着MHD的扩展，患者容易发生松果体钙化；钙化面积越大，MT分泌越少，患者更容易发生OP，这表明MT与OP呈负相关。炎症因子，如TNF-α、IL-6和IL-1，通常表现出促进骨吸收和抑制骨形成的作用；特别地，TNF-α可以诱导成骨细胞中的基质细胞表达并刺激破骨细胞活化。IL-1可促进破骨细胞前体细胞增殖和分化，增强破骨细胞活性，使骨吸收大于骨形成并诱导OP[17]。当氧化剂-抗氧化功能在体内不平衡时，它将抑制成骨细胞前体细胞分化为成骨细胞，抑制成骨细胞的矿化并诱导其死亡。AOPP通过激活NF-κB途径抑制成骨细胞样细胞的增殖和分化。此外，MDA可以抑制蛋白质和核酸合成，降低酶活性，导致体内抗氧化物质减少，从而逐渐减少骨量。OS刺激破骨细胞生长和分化后，破骨细胞反过来会产生更多的ROS，加剧对体内抗氧化防御机制的破坏并形成恶性循环，最终导致广泛的OP[18]。

总之，MHD患者易患OP，并且存在显著的OS和炎症状态；患者的MT水平，OS和炎症程度与OP密切相关。临床探讨其关系对降低接受MHD的CRF患者OP的发生率具有重要意义。