铜和镉对草鱼肾脏中3种白细胞介素基因表达的影响

江红霞，凌洁彬，叶凯甲，李学军

( 河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007 )

随着工农业的发展，大量的重金属废弃物流入河流、湖泊和水库等水域中，对水域生态环境造成了严重的污染。在水环境中，重金属离子先富集于底泥中，然后被浮游生物富集，再通过食物链进入鱼体大量蓄积，并最终进入人体，对人体的生长发育造成危害，甚至危及人类的生命安全。为保护水生态环境，并最终保护人类的健康，研究重金属对鱼类的毒性作用具有非常重要的意义。重金属铜(Cu)是鱼类必需的微量元素之一，也是水产养殖中的常用药物成分，但过量的铜又对鱼类有毒害作用，会损伤鱼类的神经生理功能，破坏嗅觉器官的结构以及内分泌等[1-2]。重金属镉(Cd)是生物机体非必需元素之一，其毒性极强，痕量镉的短期胁迫就可对鱼类产生毒性效应及其他生物学效应，导致鱼类各组织器官出现损害，从而对其生长发育及生殖造成影响[3-4]。

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是我国特有的淡水性鱼类，为我国四大家鱼之一，是人工养殖的主要种类之一，每年产量居于世界前列。目前有关草鱼的研究主要集中在营养价值、转基因抗病、人工繁殖、疾病防治等方面，有关养殖水环境重金属污染对草鱼的毒性效应的研究也有较多报道[5-9]，但水环境重金属铜和镉对草鱼免疫系统的破坏以及对其免疫基因表达的影响均未见报道。笔者主要研究水体中不同含量的Cu2+和Cd2+暴露对草鱼肾脏组织中3种免疫基因——白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10基因表达的影响，以期为研究重金属对鱼类的免疫毒性机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及饲养管理

试验鱼购自新乡市水产市场，体长(8.0±1.0) cm、体质量(10.0±1.0) g，实验室暂养7 d后进行试验。试验容器为100 cm×50 cm×40 cm的200 L塑料水箱，每箱放水100 L，放鱼10尾。试验期间使用小型增氧机增氧，溶解氧>9 mg/L，光暗周期为12L∶12D，水温为(26±2) ℃，pH 7～8。每日投喂市售商品饲料1～2次，并及时清除残饵及粪便。

1.2 重金属处理

将分析纯CuSO4·5H2O和CdCl2·2.5H2O用去离子水配制成1 g/L的母液。按照国家渔业水质标准中Cu2+的质量浓度≤0.01 mg/L以及Cd2+的质量浓度≤0.005 mg/L，重金属Cu2+和Cd2+分别设置了5个质量浓度梯度。Cu2+的质量浓度梯度分别0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg/L(依次为国家渔业水质标准允许质量浓度的10、20、40、60、80倍)；Cd2+的质量浓度梯度分别为0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L(依次为国家渔业水质标准允许质量浓度的10、20、40、60、80倍)。对照组中不添加CuSO4·5H2O和CdCl2·2.5H2O，Cu2+和Cd2+的质量浓度均以0.00 mg/L计。试验期间，日换水1次，使Cu2+和Cd2+的质量浓度保持稳定。并分别于暴露2、4、6 d和8 d后在每个处理组和对照组中随机采集5尾试验鱼，冰盘解剖，取出草鱼完整的肾脏(包括头肾和中肾)，液氮迅速冷冻后置于冰箱-80 ℃保存。

1.3 RNA提取

按试剂盒Total RNA kit Ⅱ(Omega 公司)的说明书提取各处理组草鱼肾脏组织的总RNA。利用NanoDrop 2000c微量紫外分光光度计(Thermo，美国)测定RNA的含量和纯度，并利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.4 实时荧光定量PCR

使用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒对各样品的总RNA进行反转录反应。将反转成的第一链cDNA置于-20 ℃保存。采用Primer Premier 5.0软件设计用于实时荧光定量PCR的特异性引物(表1)，引物设计所依据的基因模板序列来源于美国国立生物技术信息中心cDNA数据库。以β-肌动蛋白基因作为内参基因，使用CFX96实时荧光PCR检测系统(Bio-Rad，USA)和SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大连)试剂进行实时荧光定量PCR。PCR反应体系(25 μL)为：SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。每个样本设置3个重复，依据2-ΔΔCt法分析试验样本中3种白细胞介素基因的相对表达量。

1.5 数据处理

试验数据以平均值±标准差表示, 采用单因素方差分析进行统计学检验, 利用SPSS 20.0软件进行数据的统计分析。统计学显著性水平设定为0.05。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

注：引物名称中IL为白细胞介素，β-actin为β-肌动蛋白.

2 结 果

2.1 铜和镉对草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达的影响

在0.80 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量显著高于2 d暴露组(P<0.05)；在其他各质量浓度的Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量均无显著差异(P>0.05)(图1a)。在6 d时，0.40、0.60 mg/L暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量显著高于对照组(P<0.05)；在8 d时，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量显著高于对照组(P<0.05)；在2、4 d时，各质量浓度Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

在0.05 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量显著高于4 d暴露组(P<0.05)；在0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量显著高于2、4、6 d暴露组(P<0.05)；在0.10 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量均无显著差异(P>0.05)(图1b)。在6 d时，0.40 mg/L Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量显著高于对照组(P<0.05)；在8 d时，0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)；在2、4 d时，各质量浓度Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

图1 不同质量浓度Cu2+和Cd2+暴露对草鱼肾脏中白细胞介素-1β 基因表达的影响不同小写字母代表同一暴露质量浓度的不同暴露时间组之间差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)；*代表同一暴露时间的不同暴露质量浓度组与对照组相比差异显著(P<0.05).其他图同.

2.2 铜和镉对草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达的影响

在0.10 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量显著高于2 d暴露组(P<0.05)；在0.40 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量显著高于2、4、6 d暴露组(P<0.05)；在0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露下，4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量显著高于2 d暴露组(P<0.05)；在0.20 mg/L Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量均无显著差异(P>0.05)(图2a)。在4、6 d时，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)；在8 d时，0.40、0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)。

在0.05 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量显著高于4 d暴露组(P<0.05)；在0.10 mg/L Cd2+暴露下，6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量显著高于2、4 d暴露组(P<0.05)；在0.20、0.30 mg/L Cd2+暴露下，6 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量显著高于2、4 d暴露组(P<0.05)；在0.40 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量均无显著差异(P>0.05)(图2b)。在2、4 d时，0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)；在6、8 d时，0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)。

图2 不同质量浓度Cu2+和Cd2+暴露对草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达的影响

2.3 铜和镉对草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达的影响

在0.60 mg/L Cu2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量显著高于2、4、6 d暴露组(P<0.05)；在0.80 mg/L Cu2+暴露下，6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量显著高于2 d暴露组(P<0.05)；0.10、0.20、0.40 mg/L Cu2+暴露下，2、4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量均无显著差异(P>0.05)(图3a)。在6 d时，0.80 mg/L Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量显著高于对照组(P<0.05)；在8 d时，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量显著高于对照组(P<0.05)；在2、4 d时，各质量浓度Cu2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

图3 不同质量浓度Cu2+和Cd2+暴露对草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达的影响

在0.20 mg/L Cd2+暴露下，8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量显著高于2、4 d暴露组(P<0.05)；在0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下，6 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量均显著高于2、4、8 d暴露组(P<0.05)；在0.05、0.10 mg/L Cd2+暴露下，2、4、6、8 d暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量均无显著差异(P>0.05)(图3b)。在6、8 d时，0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)；在2、4 d时，各质量浓度Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

近年来，水产养殖业暴发性病害的相继发生引起了养殖鱼类的大规模死亡，造成了渔业生产的巨大经济损失。病害发生的原因之一就是工农业生产过程中排放的大量污水使得养殖水域污染不断加重，水环境质量逐年恶化。因此，研究水体污染物包括水环境中的重金属对养殖鱼类的免疫毒性及其毒性机制，对养殖水环境保护和鱼类病害防治均有重要的意义。肾脏是鱼类重要的免疫器官，外界病原和污染物的刺激会使肾脏产生相应的免疫细胞和免疫因子，从而对鱼体进行免疫调节。白细胞介素是鱼体中的一类重要的免疫因子，它是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名。迄今，已发现有33种白细胞介素参与免疫调节、造血、炎症反应等过程[10]。近年来，白细胞介素作为鱼类重要的免疫细胞因子，已得到广泛研究，相继在各种鱼类中克隆得到了白细胞介素-1[11]、白细胞介素-2[12]、白细胞介素-4[13]、白细胞介素-8[14]和白细胞介素-10[15]的全长基因，这些白细胞介素在鱼类的免疫调节中均发挥着重要的作用。

3.1 草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因在铜和镉胁迫下的表达变化

白细胞介素-1是在局部和全身炎症反应中起关键作用的细胞因子，是重要的炎症和一般起始反应的介质，在级联反应中可调控其他细胞因子的表达。在哺乳动物中已发现11种白细胞介素-1家族成员，包括白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-1ra、白细胞介素-18、白细胞介素-1F5和白细胞介素-33等[16]，但目前在鱼类中只发现了白细胞介素-1β和白细胞介素-18[17]。本试验研究了Cu2+和Cd2+暴露对草鱼肾脏白细胞介素-1β基因表达的影响。结果发现，当Cu2+和Cd2+暴露到第8 d时，0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露组、0.20、0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露组的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)，说明长时间高质量浓度的Cu2+和Cd2+暴露，对草鱼的肾脏造成了一定的损伤，引起了草鱼肾脏细胞的炎症反应，其炎症细胞因子白细胞介素-1β的基因表达量显著升高，从而促进肾脏细胞的免疫调节。

3.2 草鱼肾脏中白细胞介素-8基因在铜和镉胁迫下的表达变化

白细胞介素-8是典型的促炎症因子，也是一种CXC型趋化性细胞因子，对中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞有趋化作用，同时具有刺激血管生成、促有丝分裂和免疫调节等作用[18]。白细胞介素-8调节炎症反应，对感染组织有一定的恢复作用[19]。本试验中，草鱼肾脏中白细胞介素-8基因表达量在较高质量浓度和较长时间的Cu2+暴露下(0.40 mg/L，8 d;0.60 mg/L,4、6、8 d;0.80 mg/L,4、6、8 d)显著高于对照组(P<0.05)，而在Cd2+暴露下，在暴露时间较长(6、8 d)时，各质量浓度组的白细胞介素-8基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)，但在高质量浓度Cd2+(0.30、0.40 mg/L)暴露下，在仅暴露2、4 d时，白细胞介素-8基因表达量就已显著高于对照组(P<0.05)。以上结果说明，白细胞介素-8基因的表达对Cd2+的暴露要比对Cu2+的暴露更加敏感，这可能是由于Cd2+对草鱼的毒性要比Cu2+强，Cd2+的暴露比Cu2+暴露对草鱼肾脏的损伤更快更严重，从而引起草鱼肾脏细胞更加灵敏的炎症反应。

3.3 草鱼肾脏中白细胞介素-10基因在铜和镉胁迫下的表达变化

白细胞介素-10又称细胞因子合成抑制因子，参与炎症反应并能缓解炎症，对机体具有保护作用，在硬骨鱼中具有免疫调节作用[20]。白细胞介素-10 mRNA的表达增加可抑制炎症反应，缓解炎症疾病，有助于治疗炎症[21]。本试验中，高质量浓度和长时间的Cu2+暴露(0.60 mg/L,8 d；0.80 mg/L,6、8 d)，以及高质量浓度(0.20、0.30、0.40 mg/L)和长时间(6、8 d)的Cd2+暴露均使草鱼肾脏中白细胞介素-10基因表达量显著高于对照组(P<0.05)，这可能是肾脏细胞为了抑制和缓解Cu2+、Cd2+暴露对肾脏所造成的炎症反应而大量合成白细胞介素-10所致。

3.4 草鱼肾脏中白细胞介素基因表达量与铜和镉的胁迫时间的关系

在本研究中，在0.80 mg/L Cu2+，0.30、0.40 mg/L Cd2+暴露下的草鱼肾脏中白细胞介素-1β基因表达量，以及在0.60、0.80 mg/L Cu2+暴露下的草鱼肾脏中白细胞介素-8和白细胞介素-10基因表达量，均随着暴露时间的增加而逐渐升高，在第8 d时达到最大值，且在第8 d时的基因表达量均显著高于第2 d时(P<0.05)。这些结果说明在高质量浓度的Cu2+暴露下的白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10基因表达量，以及在高质量浓度Cd2+暴露下的白细胞介素-1β基因表达量，均与暴露时间呈现出一定的正相关关系，其表达量具有一定的时间依赖性。这可能是因为Cu2+和Cd2+暴露的时间越长，草鱼肾脏受到的损伤越严重，其炎症反应也越强烈，肾脏细胞产生的各种促炎症因子和细胞因子合成抑制因子也越多。

4 结 论

总之，本研究利用实时荧光定量PCR初步分析了草鱼在水体铜和镉胁迫下，其肾脏中的免疫细胞因子——白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10的基因表达量的变化，试验结果表明，高质量浓度和长时间的Cu2+和Cd2+暴露会使草鱼肾脏中的白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10基因表达量显著增加，且高质量浓度的Cu2+暴露下的白细胞介素-1β、白细胞介素-8和白细胞介素-10以及高质量浓度Cd2+暴露下的白细胞介素-1β基因表达量具有一定的时间依赖性。本研究结果为后续深入研究重金属对鱼类的免疫毒性机制，提高环境污染条件下的鱼类抗病力奠定了基础。