毛蕊花糖苷与99Tc-MDP联合治疗糖皮质激素诱导大鼠骨质疏松的效果及其分子机制研究

孙玉兰 刁云鹏 孙伟 王琳 李禾 李淼 王萍 冯英霞 徐岩 宫宇 王青

1. 大连市友谊医院风湿免疫科，辽宁 大连116000 2. 大连医科大学转化医学院，辽宁 大连 116044

骨质疏松症(osteoporosis) 是指各种原因导致的骨组织微结构破坏，骨质脆性增加，进而引发骨折的一种代谢性的骨骼系统的疾病[1]，其临床症状主要表现为腰背疼痛、身长缩短以及易发生骨折等，严重影响了患者的身体健康以及生活质量，目前我国的老年人中的患病比例已经超过50%[2]。因此，有效预防骨质疏松非常重要。

骨质疏松症按病因分类，主要分为原发性和继发性骨质疏松症，而继发性骨质疏松的众多引发因素里，糖皮质激素引发的骨质疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIO)最为常见[3-4]。

双膦酸盐是破骨细胞的强有力的抑制剂，临床应用超过15年，其对于骨质疏松症以及其他病理性骨折等有很好的防治作用，但是其可以导致患者颌骨发生坏死[5]。从临床疗效观察来看，目前对于糖皮质激素致骨质疏松症防治方法效果均不佳，不能有效预防骨折的发生。

锝(99Tc)亚甲基双膦酸盐(99-Technetium-methylene diphosphonate,99Tc-MDP)对骨组织具有良好靶向性，能够治疗由于骨质丢失造成的骨质疏松[6]。目前，99Tc-亚甲基双膦酸盐在临床上已经被广泛应用于类风湿关节炎等其他自身免疫性疾病及骨科相关疾病。但是其对于GIO的预防作用的研究仍然罕见[7]。

毛蕊花糖苷(Ver)是一种典型的苯乙醇苷，可显着增加成骨细胞的生长和分化[8]，并可抑制破骨细胞的分化和成熟[9]。这些表明Ver可能有助于预防骨质疏松症。然而，目前尚不清楚Ver能否保护骨骼免受糖皮质激素的伤害。因此，本研究旨在探讨Ver对糖皮质激素诱导的骨量丢失的改善作用，并阐明潜在的分子机制。

Koh等[10]报道FLT3在绝经后妇女的骨质疏松症和随后的骨折中发挥作用。 此外，FLT3已被证明在破骨细胞分化和功能中起关键作用[11]。泛素特异性肽酶(ubiquitin-specific protease, USP)10是泛素特异性蛋白酶(USP)家族的成员。Weisberg等[12]证实USP10是稳定FLT3所需的关键的去泛素化酶，并且抑制USP10可诱导FLT3蛋白的降解。

本课题通过基础研究探讨毛蕊花糖苷及99Tc-亚甲基二膦酸盐在预防糖皮质激素致骨质疏松过程中潜在的药理协同作用，并进一步分析USP10/FLT3的作用及其意义。

1 材料和方法

1.1试剂与仪器

地塞米松磷酸钠注射液由济南利民制药有限责任公司生产，5 mL/支，(批准文号：国药准字H37021224)、99Tc-亚甲基双膦酸盐由成都云克药业有限责任公司生产，剂型分为A、B剂：A剂(液体)含99锝量为5 μg/mL，B剂(冻干粉剂)内含亚甲基双膦酸钠5 mg，氯化亚锡0.5 mg(批准文号：国药准字：H20000218)；毛蕊花糖苷购自大连美仑生物试剂公司；骨密度仪(GE Lunar PRODIGY型，美国)；万能材料试验机(岛津AG，日本)。

1.2动物模型

48只雌性SD大鼠(200±20)g由大连医科大学SPF动物实验中心提供，大鼠可以自由采食水和食物。所有动物实验均按照机构指南进行。将SD大鼠随机分为4组，对照组大鼠正常饲养；其他4组大鼠接受肌肉注射地塞米松磷酸钠(1 mg/kg)，每周2次，制作骨质疏松模型；在Dex造模1 h后，Ver组灌胃给予Ver(30 mg/kg),99Tc-MDP治疗组大鼠尾静脉注射5 mg/kg99Tc-MDP，联合治疗组大鼠灌胃Ver同时，尾静脉注射5 mg/kg99Tc-MDP，每周2次，连续给药8周。造模成功后老鼠常规喂养一周。实验结束时，大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉，骨密度测定，同时确定是否造模成功，腹主动脉放血处死并取材备用。

1.3骨密度测定

双能X线吸收法(dual-energy X-ray absorption, DXA)骨密度仪进行扫描，扫描的部位包括全身、腰椎体及股骨。每次扫描时使鼠处于俯卧位，后肢维持在外旋位，股骨与胫骨呈90°角。

1.4生物力学参数测定

剔除左侧股骨肌肉及软组织，分别在万能材料试验机进行进行三点弯曲力学实验检测。支点跨距选择18 mm；以中点为加压点，加载速率设置5.0 mm/min；温度23 ℃；周围湿度60%～70%，测出各组大鼠股骨的最大载荷、弹性载荷、弹性位移及弹性模量等参数。

1.5血清生化指标检测

采用酶联免疫分析法，根据试剂盒说明书，检测血液中骨形成指标：骨钙素(osteocalcin)及I型原胶原N-端肽(procollagen type I N-terminal propeptide)；骨吸收指标：I型胶原交联C-末端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen)。

1.6Western blot 检测

将股骨头组织用液氮预冷，取出称重后研磨至粉末状，50 mg 骨组织加200 μL RIPA 裂解液制备样品。根据BCA的程序测定蛋白(BCA)，以牛血清白蛋白为标准。蛋白质(20 μg)用含有β-巯基乙醇的电泳样品缓冲液和预制的10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至PVDF膜。在37 ℃条件下，用含有5%脱脂牛奶的Tris缓冲液[含0.1% Tween-20(TBST)]封闭膜2 h。之后用1∶1000稀释的一抗USP10，FLT3以及β-肌动蛋白抗体在4 ℃过夜孵育。随后用TBST洗涤，然后用第二抗体孵育。再用TBST充分洗涤后，将膜暴露在增强的化学发光试剂(ECL)下。用Biospectrum-410多光谱成像系统和化学HR相机410记录发出的光。在透射紫外光下观察和拍摄蛋白条带。使用image-pro plus 软件进行半定量分析。

1.7统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组的数据均表示为平均值±标准差，两组比较采用单因素方差分析。在所有的统计分析中，P<0.05或P<0.01都可表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1Ver及99Tc-MDP改善Dex导致的大鼠体重及股骨干重的下降

结果如表1所示，模型组大鼠体重增加明显要低于正常对照组大鼠；但相对于模型组，各治疗组大鼠体重均增长明显。同时，糖皮质激素能使大鼠骨干重明显下降，而各治疗组能明显预防骨质疏松症大鼠骨干重的下降。

组别实验前体重实验后体重实验后股骨干重对照组(n=12)209.5±34.8254.1±32.30.49±0.05模型组(n=12)211.6±31.1&214.5±29.3∗0.37±0.04∗99Tc-MDP组(n=12)212.4±29.3#230.4±31.9#0.44±0.03#Ver 组(n=12)217.1±26.5#238.4±41.1#0.44±0.05#联合组(n=12)214.5±37.2#237.3±34.2#0.47±0.04#

注: 与对照组比较，*P<0. 05; 与模型组比较，#P<0.05；与对照组比较，&P>0.05。

2.2Ver及99Tc-MDP改善Dex导致的大鼠骨密度及骨生物力学参数的下降

通过DXA骨密度仪扫描(图1)，结果如表2所示。与正常对照组比较，模型组大鼠全身、腰椎体及股骨骨密度明显降低；而治疗组均能使骨质疏松症大鼠各部位骨密度显著升高。三点弯曲实验中，最大载荷、弹性模量、弹性位移和弹性载荷都有明显降低(见表3)；而治疗组均能改善糖皮质激素所致的上述骨生物力学参数的下降。

图1 双能X线吸收法扫描模型大鼠全身骨密度(R1股骨；R2腰椎)Fig.1 Bone mineral density of rats in model group scanned with DEXA (R1: the femur; R2: the lumbar vertebrae)

组别全身骨密度腰椎体骨密度股骨骨密度对照组(n=12)0.164±0.0040.221±0.0040.182±0.007模型组(n=12)0.112±0.010∗0.168±0.008∗0.137±0.010∗99Tc-MDP组(n=12)0.147±0.007#0.195±0.020#0.168±0.010#Ver 组(n=12)0.145±0.008#0.199±0.007#0.165±0.005#联合组(n=12)0.158±0.006#0.207±0.010#0.178±0.010#

注: 与对照组比较，*P<0. 05; 与模型组比较，#P<0.05。

组别弹性模量/(MPa)最大载荷/(N)弹性载荷/(N)弹性位移/(mm)对照组(n=12)2563±125.6256±19.5208±17.60.45±0.02模型组(n=12)2131±148.6∗177±35.1∗131±26.3∗0.33±0.02∗99Tc-MDP组(n=12)2413±129.8#230±41.6#180±31.8#0.41±0.04#Ver 组(n=12)2387±164.8#223±41.8#177±35.2#0.39±0.04#联合组(n=12)2477±159.4#241±44.5#181±28.7#0.42±0.04#

注: 与对照组比较，*P<0. 05; 与模型组比较，#P<0.05。

2.3Ver及99Tc-MDP改善Dex导致的大鼠骨代谢相关血液指标异常

结果如表4 所示。与正常对照组比较，模型组大鼠骨形成指标：骨钙素明显降低，PINP无明显改变；骨吸收指标：CTX-1同样明显降低；而治疗组均能使上述骨代谢指标显著改善。

图2 Ver对USP10、FLT3蛋白的表达的影响注：柱状图显示了由β-actin标准化后的各蛋白的相对表达比。与对照组比较，*P<0.05; 与模型组比较，&P>0.05；与模型组比较，#P<0.05。Fig.2 Effect of Ver on the protein expressions of USP10 and FLT3 in GIO rats

组别BGPPINPCTX-1对照组(n=12)2011.6±133.185.3±7.148.3±6.8模型组(n=12)1571.5±114.2∗83.7±10.239.2±7.2∗99Tc-MDP组(n=12)1779.8±129.5#82.6±9.945.4±7.9#Ver 组(n=12)1784.6±122.8#83.5±11.545.6±6.5#联合组(n=12)1809.3±131.5#84.8±13.247.4±7.1#

注: 与对照组比较，*P<0. 05; 与模型组比较，#P<0.05。

2.4Ver降低Dex导致的大鼠骨组织中USP10及FLT3的上调

Western blot结果(图1)表明模型大鼠骨组织内USP10和FLT3的表达比空白组明显增加。而Ver组及联合治疗组均能使骨质疏松症大鼠骨组织中USP10/FLT3显著降低。值得注意的是，两Ver治疗组之间USP10和FLT3的表达没有显著差异，而模型组与99Tc-MDP治疗组之间差异无统计学意义，说明99Tc-MDP并不影响USP10/FLT3信号通路，即Ver与99Tc-MDP治疗GIO的分子机制不同。

3 讨论

糖皮质激素被广泛用于治疗炎症及免疫调节紊乱性疾病。然而，长期连续使用会导致如骨质疏松、增加骨折风险等不良反应[13-14]。双膦酸盐类为目前在防治糖皮质激素诱导的骨质疏松药物中疗效最为显著，能够增加骨密度及降低脊柱骨折的风险，双膦酸盐类药物能够对糖皮质激素诱导的骨质疏松有预防与治疗的效果。但有报道发现双膦酸盐可以导致颌骨坏死，这一现象称为双膦酸盐相关性颌骨坏死。

而我国自主研发的新药锝(99Tc)亚甲基双膦酸盐中的99Tc可通过清除自由基，调节免疫功能；另一方面，MDP作为双膦酸盐类化合物，对骨组织尤其病变骨具有良好靶向性，主要被骨中羟磷灰石晶体吸附和与未成熟胶原结合，以修复病灶骨，同时它又能抑制破骨细胞活性，防止羟基磷灰石晶体溶解，抑制骨吸收。改变病骨细胞生存的微环境，抑制和修复骨病灶，防止病理性骨折。近年来99Tc-亚甲基双膦酸盐在国内已广泛应用于自身免疫性疾病及骨科疾病，并已取得了较好的效果，无明显的下颌骨坏死及发热等不良反应，值得注意的是，尽管锝亚甲基双膦酸盐目前使用安全，但其具有一定的辐射，临床应注意患者安全使用。因此，有理由认为99Tc-MDP对风湿免疫疾病患者具有免疫抑制和预防骨质疏松的双重临床意义。

在该研究中，成功建立GIO大鼠模型后，模型组大鼠的体重、股骨干重明显降低，骨代谢相关血液指标明显异常，骨钙素是成骨细胞特有的一种分泌蛋白，其血液含量可直接反映成骨细胞的活性，被认为是骨形成或骨转换过程中敏感的生化指标[15-16]，在该研究中，GIO大鼠血液中的骨钙素含量明显降低，而另一种骨形成指标PINP[17]并无明显改变；CTX-1存在于成熟的骨胶原中，当破骨细胞溶解骨胶原时被释放，CTX-1是目前公认骨吸收指标[18]，而在该研究中，Dex导致模型大鼠CTX-1含量明显降低，其机制有待研究。同时DXA骨密度测定提示大鼠全身、腰椎体及股骨骨密度均明显降低；股骨三点弯曲实验弹性模量、最大载荷、弹性位移和弹性载荷都明显降低；Western blot结果显示，模型组骨组织中USP10及FLT3表达较对照组明显增加。而经过毛蕊花糖苷治疗后，上述症状都明显改善，99Tc-MDP联合治疗效果更佳明显。同时值得注意的是，毛蕊花糖苷能够使得GIO大鼠骨组织中 USP10/FLT3蛋白表达明显降低，但99Tc-MDP治疗组与模型组之间USP10/FLT3蛋白表达没有显著差异，说明Ver与99Tc-MDP治疗GIO的分子机制不同。。

综上，研究结果说明，毛蕊花糖苷能抑制GIO大鼠USP10/FLT3通路的活性，降低USP10/FLT3的蛋白表达来改善Dex引起的大鼠骨质疏松；而毛蕊花糖苷和99Tc-MDP治疗GIO大鼠具有良好的药理协同作用，并且是通过作用不同的分子靶点而完成的。