全麦粉和小麦粉中烷基间苯二酚同系物组成的对比分析

邹燕羽，方勇，李彭，黄沁沁，夏季，刘琴，谢旻皓，胡秋辉

（南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京 210023）

0 引言

【研究意义】烷基间苯二酚（Alkylresorcinols，ARs），是 1,3-二羟基-5-烷基苯衍生物的总称，其苯环第5位上主要由奇数个碳烷基侧链取代，主要由5-十七烷基间苯二酚（C17:0）、5-十九烷基间苯二酚（C19:0）、5-二十一烷基间苯二酚（C21:0）、5-二十三烷基间苯二酚（C23:0）和5-二十五烷基间苯二酚（C25:0）等多个同系物组成[1]。ARs是主要存在于小麦、黑麦等谷物麸皮中的一类具有两亲性[2]的特殊酚类类脂，具有多种生理功能，如抗氧化作用[3]、抑菌性[4-5]、对肿瘤具有抑制作用[6]等，受到研究者的广泛关注。近年来，人们对谷物营养方面的需求，已从追求产品精细化转变为强调谷物产品应在合理加工前提下最大程度的保留其营养成分，全麦粉产品深受消费者青睐[7]。1999年，美国谷物化学协会（AACC）将全麦粉定义为：由小麦（硬质小麦除外）制备而成的，保留完整麸皮、胚芽和胚乳，各组分含量比例与整粒小麦一致[8]。与小麦粉相比，全麦粉含有更多的维生素、矿物质、抗氧化剂和其他营养物质。美国食品药品管理局（FDA）认为摄入全麦粉可降低慢性流行病的发病率，并将全麦粉纳入居民膳食指南[9-10]。然而中国对全麦粉的研究尚处于起步阶段，尚未建立全麦粉的制粉工艺和品质等级标准，甚至对全麦粉的定义都不清楚。目前，国内全麦粉产品行业发展迅速，市场上出现了形形色色的全麦粉产品，但质量参差不齐。不良商家为谋取利益，将普通小麦粉与少量麸皮混合或者直接将小麦粉冒充全麦粉进行销售。这种以次充好欺骗消费者的不良行为严重影响到我国全麦粉市场秩序，甚至影响到我国粮食流通与国际贸易合作。而在前人的研究中发现ARs是判断全麦粉食品的生物标记，可作为鉴别全麦食品是否富含麦粉或麸皮的一种客观方法[11-12]。且ARs主要存在于小麦的麸皮中，几乎不存在于胚乳和胚芽中，因此能够作为判断全麦粉产品的有效指标[13]。ARs对全麦粉品质特性影响较大，研究麦粉产品中ARs同系物组成有助于全麦粉、小麦粉产品原料的筛选，对全麦粉产品品质的把控具有积极指导作用。通过高效液相建立一种有效、稳定的ARs同系物检测方法，进行全麦粉、小麦粉和小麦麸皮中ARs同系物组成的对比分析研究，在ARs同系物组成检测分析技术、全麦粉产品真伪判别和麦类全谷物产品品质控制方面具有重要的意义。【前人研究进展】在ARs的提取技术方面，目前的研究大部分存在提取效率低、提取量少的问题。例如，ROSS等[14]选用乙酸乙酯作为提取溶剂，常温下振荡24 h后可得ARs粗提物，但提取效率不高。GUNENC等[15]利用近年来发展起来的超临界流体萃取分离提取技术，通过调整极性助溶剂与非极性流体的比例提高了ARs萃取率。虽然超临界流体萃取技术具有诸多优点，但是由于设备操作成本高、分离提取量小，该方法难以应用于大规模工业化生产。彭田园等[16]采用超声波辅助提取手段，将提取时间由48 h缩短至2 min，且样品用量少、重复性好，适用于全麦粉中ARs的快速提取。同时，超声波辅助提取伴随着机械效应，使溶剂和物料充分接触，加快有效成分的溶出且对提取物中热稳定性差的活性组分破坏性较低[17]。但是超声波细胞粉碎机提取量较少，不适用于ARs的大量提取。在ARs检测方法的研究方面，目前国内关于麦谷类中ARs的检测技术及ARs作为全麦产品标记物方面的研究仍鲜有报道。例如，国家粮食和物资储备局于2015年提出粮食行业标准[18]，其中指出在室温下振荡48 h进行ARs的提取，采用分光光度法测定全麦粉中ARs的含量，但局限于ARs的定量，且提取过程费时。王宇飞等[19]通过建立液相-荧光法对全麦粉中的 ARs进行了准确测量，操作简单、灵敏度高。在ARs同系物组成研究方面，C15:0在小麦中含量很少，仅在黑麦中少量存在[12]，因此人们对ARs同系物的研究主要集中在C17:0—C25:0，关于C15:0的研究较少。对小麦中ARs同系物的相对组成研究表明，小麦中的优势ARs同系物为C21:0[20-21]。LIU等[22]对21个不同小麦品种进行ARs同系物组成分析，表明ARs同系物C19:0和C21:0最丰富，其次是C17:0、C23:0和 C25:0。【本研究切入点】目前，ARs的研究仅处于初级阶段，大多数研究只涉及ARs的提取和含量测定的方法，且耗时，效率低，缺乏系统性，未深入到其同系物组成研究分析和真伪全麦粉品质评价方面。【拟解决的关键问题】本研究选用市场流通中可购得的全麦粉、小麦粉和实验室自制麸皮作为研究对象，对全麦粉、小麦粉和小麦麸皮共47份样品中ARs同系物组成进行分析，为全麦粉真伪判别研究提供理论依据和技术支持，同时为全麦粉真伪评价和质量控制提供可靠依据。

1 材料与方法

试验于2018年12月至2019年6月在南京财经大学的江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室进行。

1.1 试验材料

试验样品共47份，即市售的26种国内外不同品牌的全麦粉，16种国内不同品牌的小麦粉和5种小麦麸皮。其中全麦粉通过超市、网店购得共13个不同企业的国内全麦粉；通过采样美国、加拿大超市购得共7种企业品牌的美国全麦粉及 6种不同品牌的加拿大全麦粉。另外，5种麸皮样品于2018年秋季采买自江苏南京市、泰州市、淮安市、宿迁市和扬州市粮食储备库。每个样品各取200 g，采用自封袋封装，于-20℃冰箱中储存备用。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，美国Agilent公司；ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美国Agilent公司；分析天平，苏州赛恩斯仪器有限公司；SB25-12DTDN超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；Hei-VAP Precision旋转蒸发仪，德国Heidolph公司；SC-3616低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；8位干式氮吹仪，博纳艾杰尔科技公司；I-mark酶标仪，美国 Bio-rad公司；FW100型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司。

5-十五烷基间苯二酚标准品（C15:0，纯度≥95%）、5-十七烷基间苯二酚（C17:0，纯度≥95%）、5-十九烷基间苯二酚（C19:0，纯度≥95%）、5-二十一烷基间苯二酚（C21:0，纯度≥95%）、5-二十三烷基间苯二酚（C23:0，纯度≥95%）和5-二十五烷基间苯二酚（C25:0，纯度≥95%）标准品均购于美国Sigma公司；重氮盐Fast blue B Zn（纯度≥95%）购于阿拉丁试剂有限公司；乙酸乙酯（分析纯），购于上海山浦化工有限公司；甲醇（色谱纯）购于美国Tedia公司；甲酸（色谱纯），购于美国ACS公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 准确称取1 g小麦麸皮样品置于50 mL离心管中，选取乙酸乙酯作为提取溶剂。以烷基间苯二酚提取率为基准，确定烷基间苯二酚前处理方法。即按照料液比（g·mL-1）1∶40，超声时间 30 min，超声功率300 W的试验参数进行超声提取。待超声提取完成后，离心（3 500 r/min，5 min）。取离心上清液于45℃进行旋转蒸发，加入5 mL乙酸乙酯导出残留物取出氮吹。使用1 mL的色谱级甲醇对其进行复溶，过0.45 μm有机滤膜后进行高效液相色谱检测。

1.3.2 烷基间苯二酚同系物的分析方法

1.3.2.1 液相参数设置 对流动相组成、流速、柱温、检测波长、进样体积等参数进行优化，选取适用于麦粉中烷基间苯二酚液相色谱检测的最佳条件。最终，选用ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent）色谱柱，相关液相色谱参数设置为：柱温35℃；A相流动相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸甲醇溶液；紫外检测波长为280 nm；流速为0.5 mL·min-1；进样量为 20 μL。

1.3.2.2 洗脱梯度 流动相洗脱条件为：0—5 min，A相15%—10%，B相85—90%；5—10 min，A相10%—5%，B相90%—95%；10—15 min，A相5%—0%，B相95%—100%；15—35 min，A相0%，B相100%。

1.3.2.3 标准样品液相混标色谱图 选用甲醇（色谱纯）为溶剂配制浓度为5 μg·mL-1的烷基间苯二酚混标溶液，采用本研究建立的液相方法得到烷基间苯二酚混标液相色谱图，及5种烷基间苯二酚同系物的保留时间。

1.3.3 方法学评价

1.3.3.1 标准曲线、线性范围、相关系数、定量限及检出限 根据5种烷基间苯二酚同系物在样品中的含量范围，设置不同烷基间苯二酚同系物质量浓度范围以绘制标准曲线，确定线性范围。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，建立线性回归方程（y=ax+b）得到相关系数（R2）。以相同的检测方法对加标样品进行检测，以3倍色谱峰信噪比作为检出限，以10倍色谱峰信噪比作为定量限[23]。

1.3.3.2 精密度、回收率 选取小麦粉样品进行 6次平行测定，以确定本方法的可靠性。获得5种烷基间苯二酚同系物各自的含量，将烷基间苯二酚总含量表示为平均值±标准差（x±SD），并计算相对标准偏差（RSD）；另外，通过向样品中添加5种烷基间苯二酚同系物标准溶液，采用外标法定量，验证建立方法的回收率。根据5种烷基间苯二酚同系物在样品中的含量水平，分别按高、中、低水平进行加标回收试验，计算回收率。按如下公式计算：

P（%）=[（m2-m1）/m3]×100

式中，P为烷基间苯二酚回收率（%）；m1为原样品中烷基间苯二酚的含量；m2为加标后总的烷基间苯二酚含量；m3为烷基间苯二酚加标的含量。

1.3.4 样品检测 对26份全麦粉、16份小麦粉及5份小麦麸皮共47份样品，采用本研究建立的烷基间苯二酚的液相检测方法对样品中的烷基间苯二酚同系物组成及总量进行测定分析，每个样品重复3次，数据表示为x±SD，并计算相对RSD。

1.4 数据处理

采用Origin 2018统计分析软件进行数据处理、分析与作图，采用JMP13分析软件进行差异显著性分析，采用 Heml分析软件进行丰度热图的绘制。差异显著性采用student t检验法，显著差异选用P＜0.05，每组试验重复3次，所得结果以x±SD的形式表示。

2 结果

2.1 烷基间苯二酚同系物液相检测方法的建立

通过了解5种ARs同系物的化学结构性质可知，侧链烷基碳链越长，ARs极性越小[24]。且由于不同同系物之间极性接近，需在一定程度上加大有机相比例，调整流动相极性才能使5种ARs的高效液相检测信号峰分开。如图1所示，5种ARs同系物混标溶液中的各个色谱峰峰形对称，分离度好，无拖尾现象。C17:0保留时间为18.04 min，C19:0保留时间为20.30 min，C21:0保留时间为22.81 min，C23:0保留时间为26.14 min，C25:0保留时间为30.79 min。在前人的研究中可以发现，ARs随着侧链上的碳链越长，溶解性越差，极性越弱，出峰时间越迟。图 1的各同系物出峰顺序与KNODLER等[25]研究结果一致，表明本研究建立的液相检测方法可检测分析ARs同系物组成。

图1 5种烷基间苯二酚同系物混合标准溶液（5 μg·mL-1）的高效液相色谱图Fig. 1 High performance liquid chromatography of 5 kinds alkylresorcinol homologues mixed standard solutions(5 μg·mL-1)

2.2 方法学评价

2.2.1 标准曲线、线性范围、相关系数、定量限、检出限及精密度 根据5种ARs同系物在样品中的含量占比不同，设置不同浓度梯度的ARs同系物进行测定，每个浓度水平重复3次。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制ARs同系物的标准曲线。如表1所示，本研究建立的方法测定5种ARs同系物，在一定范围内，其线性相关系数均大于0.999，检出限及定量限均在μg·mL-1。使用建立的液相色谱检测方法，选取待检测试样中的1份美国全麦粉中的5种ARs同系物进行检测，设置6个平行进行精密度评价，其 RSD均在5%以内，表明仪器精密度良好。

表1 5种烷基间苯二酚同系物线性方程、相关系数、检出限、定量限及精密度Table 1 Linear regression equation, determination coefficient, LOD, LOQ and precision of five kinds ARs homologues

2.2.2 回收率 前期研究中，笔者发现全麦粉和精制小麦粉的回收结果没有显著差异，考虑到全麦面粉的基质更为复杂，最终在回收研究中使用了全麦粉[26]。因此，选取 1种中国市售全麦粉作为加标基质，对5种ARs同系物进行加标试验。设计低、中、高3个水平，分别设置3个平行组。经检测，如表2所示，3个水平加标回收率为81.16%—112.92%，RSD在0.02%—4.02%，表明该检测方法准确可靠，可用于小麦及其制品中ARs的定性、定量检测。

2.3 热图分析

ARs的含量可作为麦粉品质评价的指标，利用高效液相对国内外全麦粉、小麦粉及小麦麸皮等共 47份样品的ARs同系物组成进行含量测定，再采用Heml软件绘制丰度热图。通过图2可以直观反映不同麦粉样品中ARs同系物组成及含量之间的差异，图中每份麦粉样品中每个ARs同系物的含量用不同深浅颜色表示，红色越深代表某种ARs同系物含量越多，蓝色越深表示某种ARs同系物含量越少。

ARs主要存在于小麦麸皮中，其总含量和同系物组成丰富度较高，可作为对照反映全麦粉和小麦粉中ARs同系物组成情况。如图2所示，美国、加拿大、中国全麦粉中ARs总含量均值分别为291.39、272.96和105.51 μg·g-1，中国小麦粉和小麦麸皮中ARs总含量均值分别为138.01和1 540.60 μg·g-1。结果表明，国外全麦粉中ARs总含量明显高于国内全麦粉。在所有麦粉样品的ARs同系物中，C19:0和C21:0含量占比大，分别为12%—44%、33%—61%，而C17:0、C23:0和C25:0含量占比小。如图所示，在部分小麦粉样品中，ARs总含量低，C17:0、C23:0和C25:0这3种同系物的含量为0，但C19:0和C21:0仍存在。图2聚类分析将C21:0和总含量聚为一类，表明C21:0是麦粉样品中最主要的ARs同系物。随着欧氏距离的增大，C19:0也随之被并到这一类中，说明 C19:0和 C21:0是占主导地位的两种同系物，这与前人研究一致[27]。另一方面，图2全麦粉中的ARs同系物组成丰富度优于小麦粉，表明不同样品中ARs同系物组成含量及总量差异显著，国外全麦粉的ARs总量显著高于国内全麦粉，全麦粉 ARs同系物组成丰富度高于小麦粉。C19:0和C21:0同系物是全麦粉、小麦粉ARs同系物组成中的特征组分，ARs同系物组成丰富度可作为区分全麦粉和小麦粉的有效指标。

表2 5种烷基间苯二酚同系物加标回收率测定(n=3)Table 2 Recovery of the five kinds ARs homologues determination by parallel tests (n=3)

图2 47份麦粉样品中烷基间苯二酚同系物组成在含量水平上的丰度热图Fig. 2 The abundance heat map of the composition of five kinds ARs homologues in wheat flour at the level of content

2.4 主成分分析

图3 47份麦粉样品中烷基间苯二酚同系物组成的主成分分析图Fig. 3 The principal component analysis of ARs homologues composition in 47 kinds wheat flour samples

对47份麦粉样品中ARs同系物组成进行主成分分析，对比麦粉样品中ARs同系物组成之间的差异。通过降维处理后，ARs同系物组成之间的差异在主向量空间中的点位置直接反应出来。如图3所示，ARs同系物含量组成提取的第1、2主成分累积贡献率分别为98.40%、0.73%，第1主成分是样品间差异的主要来源，几乎提取了原始数据的全部信息，极具代表性。小麦麸皮与其他麦粉样品的相对分散最远，表明其 ARs同系物组成差异相对最大，分析原因可能是小麦麸皮中ARs主要分布在小麦麸皮中，其ARs组成丰富度最高。美国全麦粉和加拿大全麦粉几乎重叠，说明其 ARs同系物组成具有较好的相似性。中国全麦粉和部分小麦粉与美国、加拿大全麦粉部分交叉，说明其在 ARs同系物组成上具有部分相似性，但国外全麦粉品质优于国内全麦粉。另一方面，中国小麦粉ARs同系物组成的分散度较大。通过主成分分析，由第1主成分ARs同系物组成差异可有效区分全麦粉和小麦粉。

3 讨论

目前，国外ARs最常用的检测分析技术是气相色谱法（GC）和气相质谱法（GC-MS）。ROSS等[27]通过GC-MS测定了小麦、黑麦、大麦等8种常用谷物中ARs的含量，研究发现大米、燕麦、玉米、高粱或小米中不存在 ARs。WIERZBICKA 等[28]建立了一种高通量气相色谱-质谱法对血浆、脂肪组织及尿液代谢物中ARs的含量进行定量测定，研究表明该方法对不同基质中化合物的分析，具有良好的选择性、灵敏度高、线性关系好。该方法可适用于大规模样本的分析，如流行病学研究。但是，GC-MS对样品前处理要求较高，样品处理时需要使用衍生剂对ARs进行衍生，容易引入杂质和干扰物，导致试验重现性差，不利于样品中ARs的检测分析[19]。选择一种快速、准确的液相方法对样品中待测物的检测分析极为重要，将直接影响后续试验的开展和进度。

本研究建立的ARs的液相检测方法是基于前期大量阅读国内外ARs的分析检测技术研究现状提出的，研究重点是全麦粉和小麦粉中烷基间苯二酚的同系物组成情况。由于全谷物涵盖甚广，因此，未对燕麦、黑麦、大麦等全谷物产品中的烷基间苯二酚予以研究。由ARs同系物结构式可知其第5位R基上含有较长的烷基链，可推断ARs同系物极性较弱，且根据“相似相溶”原理，随着烷基链的增长其极性减弱，水溶性越差。而在早期已有的ARs液相方法中，常采用甲醇-水体系对麦类样品中的 ARs进行梯度洗脱而实现检测分析[29-31]。本研究对样品前处理方法、流动相组成、流速、柱温、检测波长、进样体积等参数，及流动相洗脱梯度进行优化，最终确定了高效液相检测ARs的色谱方法。

ANDERSSON等[32]对131个冬小麦中的ARs进行研究，发现 ARs含量范围为220—652 μg·g-1。本研究结果表明美国、加拿大全麦粉优于中国全麦粉，中国市场上的麦粉类产品质量差异较大。同时，全麦粉粮食行业标准 LS/T3244—2015中规定了全麦粉中ARs的含量应不得低于200 μg·g-1[18]，本研究检测的国内全麦粉中ARs含量均值为105.51 μg·g-1，未达到粮食行业关于全麦粉中ARs含量的规定。BORDIGA等[20]对小麦中ARs同系物组成进行研究，结果表明小麦中的 ARs主要同系物种类为 C21:0，其次是C19:0（31%）和C23:0（11%），C17:0和C25:0分别仅占总含量的4%和5%。CHEN等[21]研究32个瑞典春、冬小麦样品，研究表明瑞典小麦样品中 ARs含量范围为 227—639 μg·g-1，其 ARs同系物含量：C21:0＞C19:0＞C23:0＞C25:0＞C17:0，本研究结果与其一致。另外，经主成分分析，中国全麦粉样品与美国、加拿大全麦粉样品在ARs同系物组成丰富度上具有相似性，而中国小麦粉在ARs同系物组成上的分散度较大，说明小麦粉品质差异较大，这可能是由加工工艺的差异引起。

目前，世界各国对全麦粉还没有统一的定义，对全麦粉的标准规定也不尽相同。西方国家对全谷物的认识始于20世纪80年代，丹麦在2008年提出的全谷物概念与美国AACC基本一致。欧盟健康谷物协会在2010年也提出了类似的全麦粉定义[33]。而我国全麦粉的研究还处于起步阶段，对全谷物尚不重视，只在2015年我国粮食行业标准LS/T 3244—2015对全麦粉作了如下定义：整粒小麦经过制粉工艺而制成的，而且小麦麸皮、胚芽和胚乳，与天然完整的颖果的相对比例基本一致的小麦全粉[34]。

在全麦粉品质鉴别方面，国内外有关全麦粉的鉴别检测方法较少，对于某一种产品是否是真正的全麦粉，各国有自己的规定，还没有统一标准的检测方法。我国尚未出台全麦粉国家标准和全麦粉鉴别检测方法。仅在 2015年的粮食行业全麦粉标准LS/T 3244—2015中规定了全麦粉中烷基间苯二酚的含量应不能低于 200 μg·g-1，总膳食纤维不低于9%，灰分不高于2.2%。各个面粉生产企业根据自己的理解制定了有关全麦粉的企业标准，但是质量检测部门抽检时，还是依据小麦粉的标准执行，显然这是不合理的。近年来，粮油企业生产的加快，人们对健康的追求和全谷物的关注度也越来越高，全谷物及全谷物食品发展迅速，尤其是全麦粉做成的全麦面包等全麦食品消费量显著提高[35]。2007年全世界市场上出现的全谷物新产品比 2000年增加了15倍，增长率为1344%[36]。而随着人们的生活水平质量不断提高，推动着居民膳食结构的转型升级，消费者变得更加注重农产品的品质和口感，越来越关注营养健康膳食，发展农产品营养标准体系已是势在必行[37-38]。但是，国内对全麦粉的研究和开发尚处于初级阶段，尚未确立全麦粉制粉工艺、分级标准。目前，尽管国内市场上的全麦粉产品数量不断增多，但产品质量参差不齐，市场还处于无序发展的状态[39-40]。ARs作为小麦全籽粒在麦谷类食品中存在的生物标志物，主要存在于小麦麸皮中，几乎不存在于胚乳和胚芽中，因而在传统麦谷类产品和精制麦谷面粉中极度缺乏 ARs。小麦麸皮口感粗糙，极大影响了全麦粉产品的适口性，进而出现了生产企业向小麦粉中添加少量麸皮冒充全麦粉来满足消费者对于营养和口感需求的现象。目前，麸皮回添法是国内最主要的全麦粉生产加工方法。一般来说，小麦麸皮粗细度达到 116目以上，所得全麦粉的适口性就能达到满足[41]。小麦细麸皮粉经膨化超微粉碎处理后，口感得到很大程度的改善，货架期明显延长[42]。因此，选择富含 ARs的小麦麸皮为原料，严格控制每道加工工艺，回添满足全麦粉产品要求比例的小麦细麸粉，能够有效地提高全麦粉适口性和营养品质。而通过检测全麦粉、小麦粉等麦谷类产品中ARs含量及其同系物组成，可对全麦粉和小麦粉产品进行有效区分，进一步实现全麦粉的真伪判别和品质控制。

4 结论

本研究建立的麦粉产品中ARs的高效液相检测方法灵敏性高、稳定性好，适用于ARs同系物组成的检测。比较47份麦粉样品ARs同系物组成，结果表明中国全麦粉中ARs总含量与美国、加拿大全麦粉差异较大，国内全麦粉ARs含量未达到国家粮食行业标准要求，国内全麦粉质量还有待提高。全麦粉产品的ARs同系物组成丰富度优于小麦粉，ARs组成可作为全麦粉判别评价的重要指标来有效区分全麦粉和小麦粉产品。因此，本研究可为全麦粉分析检测、真伪判别和品质控制提供方法支持。