腱糖蛋白-W在不同发育阶段C57BL/6小鼠耳蜗中的表达*

陆菲 雷文静 范贝 梁鹏飞 李薇 陈俊 查定军

细胞外基质对于正常组织的结构维持、细胞行为调节以及基因表达有重要的作用[1]。腱糖蛋白是细胞外基质中的一种多功能、表达模式各异的糖蛋白家族[2]，由N-末端头区、半胱氨酸域、表皮生长因子(EGF)重复序列、Ⅲ型纤维连接蛋白(FN-Ⅲ)样重复结构、C-末端纤维蛋白原结构组成[3]。该家族的成员包括腱糖蛋白-C(tenascin-C)、腱糖蛋白-R(tenascin-R)、腱糖蛋白-X(tenascin-X)，以及最后被发现的腱糖蛋白-W (tenascin-W)，也称作腱糖蛋白-N(tenascin-N)。应用序列同源性搜索基因组数据库，证实tenascin-W是最后一个腱糖蛋白家族成员[2]。Weber首次在斑马鱼中发现该蛋白[4]，故而命名为“tenascin-W”。该蛋白在小鼠中的同系物由Neidhardt首次发现，因而被命名为“tenascin-N”[5]，后通过同线性分析证实tenascin-N就是tenascin-W。

TNN基因编码腱糖蛋白-W(tenascin-W，TN-W),在人类该基因称为TNN，在鼠类称为Tnn。tenascin-C 和tenascin-W均可形成六臂体结构[1]，推测其具有相似的功能。tenascin-C蛋白中某些结构的功能已经实验证实，因而tenascin-W蛋白潜在的功能可通过对目前已发表的tenascin-C的研究结果进行预测，二者的FN-Ⅲ样结构均包含整合素结合位点，可以结合并激活toll样受体4(TLR4)[6]。tenascin-W、tenascin-C均可以与Wnt3a结合，但是与之结合的部位并不清楚[7]。tenascin-W与tenascin-C的EGF重复序列几乎相同，后者被证实可以激活EGF受体[8]。研究发现tenascin-W在中枢神经系统中多由神经元表达[5]。已有对耳聋家系的研究证实TNC基因的突变可引起家系常染色体显性遗传性聋，该基因编码tenascin-C[9]，研究表明tenascin-C在毒性损伤所致的鸟类前庭器官感觉受体的修复中发挥作用[10]，故而推断该基因突变可能引起耳蜗内修复功能的异常，导致听力逐渐下降。目前尚无文献报道Tnn基因在小鼠耳蜗中的表达模式及相关功能研究，故本研究通过观察Tnn基因编码的tenascin-W在不同发育阶段小鼠耳蜗的表达情况，初步探讨其在听觉系统中的功能。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 实验用C57BL/6小鼠来源于空军军医大学实验动物中心SPF级动物房。取出生后(postnatal day，P)1、3、7、14、28天(P1、P3、P7、P14、P28)的C57BL/6小鼠各6只，每个阶段取3只小鼠(6只耳蜗)用于冰冻切片免疫荧光标记观察，3只小鼠(6只耳蜗)用于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测；另取3只P7小鼠(6只耳蜗)用于Western blot检测。

1.2主要试剂 蛋白提取试剂盒购自美国Invent公司，耳蜗总RNA提取、反转录、RT-qPCR试剂盒购自日本TAKARA公司，TNN抗体、免疫荧光二抗抗体购自美国Invitrogen公司，Ⅲ型β-tubulin抗体、β-actin抗体购自美国Gene Tex公司，DAPI、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒购自北京Solarbio公司。驴血清购自西安晶彩生物科技公司，Tnn及β-actin 的RT-qPCR引物由擎科泽西生物科技公司合成。辣根过氧化酶抗兔抗体购自晶彩科技有限公司，免疫荧光及Western blot抗体稀释液购自上海碧云天生物技术公司。

1.3免疫荧光染色检测小鼠耳蜗tenascin-W表达 对不同发育时期小鼠耳蜗取材，P7及P7天龄以下的小鼠直接断头后迅速取出耳蜗后用多聚甲醛灌注固定，大于P7天龄的小鼠水合氯醛麻醉后迅速取出耳蜗，依次进行4%多聚甲醛固定、10%EDTA脱钙、30%蔗糖脱水、OCT包埋剂包埋后，于冰冻切片机行耳蜗连续冰冻组织切片，片厚10 μm，置于-20 ℃保存。采用免疫荧光的方法检测小鼠耳蜗中的tenascin-W的表达情况，SGNs用特异性抗体Ⅲ型β-tubulin标记。Triton打孔，驴血清37 ℃封闭30 min，一抗4 ℃孵育3 d，二抗4 ℃孵育1 d，DAPI染核10 min。目标蛋白的平均荧光强度采用Image-Pro Plus软件进行测量。同时设置PBS空白对照组。

1.4RT-qPCR检测 收集P1、P3、P7、P14、P28期的小鼠耳蜗样本，进行总RNA的提取，测量浓度后调至统一标准，按照相同的体系反转录为cDNA，转录后的cDNA放于-20 ℃进行保存。搜索哈佛大学Primer Bank查找Tnn基因的引物，进行BLAST验证。最终选取目的基因Tnn引物上游为5'-AGGTGAGGGCAGACTTACAGA-3'，下游5'-CGACAGCTTGTACCGCTCTTT-3'，内参β-actin引物上游为5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游为5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。操作方法参照TAKARA总RNA提取、反转录及实时定量试剂盒标准。反转录反应条件为37 ℃退火15 min，85 ℃延伸5 s。RT-qPCR反应条件为：95 ℃预变形30 s，PCR反应采取三步法，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环39次。RT-qPCR仪器型号为CFX96，计算方法为每个样品的阈值循环次数Cq值，应用熔解曲线分析引物扩增的特异性，目的基因的相对表达量采用和内参基因β-actin比较，计算方法为2-ΔΔCq，用归一法比较各阶段Tnn mRNA的相对表达量。

1.5Western blot检测 收集P7小鼠耳蜗的样本并提取总蛋白，因为基于RT-qPCR结果，P7小鼠耳蜗tenascin-W mRNA相对表达量最高，故只取P7小鼠进行该实验，方法参照Invent试剂盒蛋白提取方法，提取后的总蛋白行BCA法定量，调整至相同浓度后加入上样缓冲液，煮沸5 min。用8%SDS聚丙烯酰胺凝胶将蛋白样品(30 μg)分离后转移至PVDF膜上，5%牛奶封闭2 h，加入一抗4 ℃过夜，TBST洗膜3次后室温孵育二抗2 h，TBST洗膜3次后行化学法发光显影。

2 结果

2.1tenascin-W在不同发育阶段小鼠耳蜗中的表达 免疫荧光标记结果提示，tenascin-W在P1、P3、P7、P14、P28小鼠的耳蜗均有表达，在P7及小于P7天龄小鼠弥漫表达于蜗管结构，包括血管纹(stria vascularis，SV)、Corti器(organ of Corti，OC)及螺旋神经节(spiral ganglion，SG)(图1)；P14、P28小鼠在OC处荧光强度降低为0，而在SG荧光强度仍较强；不同发育阶段小鼠耳蜗SV处均检测到tenascin-W(图1)。在P1、P3小鼠耳蜗，tenascin-W蛋白在SG和OC的平均荧光强度无统计学差异(均为P>0.05)；在P7、P14、P28小鼠耳蜗SG与OC的平均荧光强度差异有统计学意义(均为P<0.001)；在P1至P28各阶段小鼠耳蜗SV处均检测到tenascin-W平均荧光强度有降低趋势，且与SG、OC比较均有统计学差异(图1，表1)。高倍镜下观察P28小鼠耳蜗SG，用DAPI染核，显示目标蛋白与核荧光染色部位不重合，tenascin-W位于核周围胞浆中(图2)。为了进一步区分该蛋白表达在SGNs或是神经胶质细胞，用Ⅲ型β-tubulin抗体特异性标记SGNs，结果显示在SG，Tnn与Ⅲ型β-tubulin共定位，表达在SGNs核周的胞体胞浆内(图3)。

表1 不同发育阶段小鼠耳蜗不同部位tenascin-W的平均荧光强度

2.2Tnn mRNA在不同发育阶段小鼠耳蜗的表达 RT-qPCR结果显示在P1、P3、P7、P14、P28小鼠耳蜗内均有Tnn mRNA的表达，相对表达量(2-ΔΔCq)分别为1.00±0.00、1.52±0.89、35.89±6.47、3.79±2.37、3.55±1.69，其中在P7小鼠耳蜗内mRNA相对表达量最高，其余各阶段相对表达量低，P7与各阶段相比差异有统计学意义(P0.001)。

2.3tenascin-W在P7小鼠耳蜗内表达的Western blot检测结果 根据RT-qPCR结果，Tnn mRNA在P7相对表达量最高，提取P7小鼠耳蜗总蛋白;Western blot结果显示在P7小鼠耳蜗提取的蛋白中检测到tenascin-W蛋白的条带，证实腱糖蛋白tenascin-W在小鼠耳蜗中有表达。空白对照在相同位置未检测到条带(图4)。

3 讨论

腱糖蛋白家族是一种细胞外基质糖蛋白，目前已有细胞外基质蛋白的病理性功能改变引起遗传性聋的报道，例如:Usherin蛋白异常引起IIA型Usher综合征[11]，IV型胶原蛋白表达的改变导致Alport综合征[12]，XI型胶原蛋白异常致非综合征型聋[13]。tenascin-W是细胞外基质腱糖蛋白家族的一员，推测该蛋白可能与听觉相关，其表达异常可能影响听觉功能。Ceacam16基因编码的蛋白为细胞黏附分子16(cell adhesion molecule 16)，由外毛细胞表达，编码的蛋白位于纤毛的顶端及盖膜，该基因的突变引起常染色体显性遗传性聋[14]。有文献报道tenascin-W表达量的改变可以引起小鼠成肌细胞黏附功能异常[1]。因此，推测tenascin-W表达异常可能与细胞黏附功能异常相关。

Tnn基因的表达模式及其在听觉系统中的作用尚未知，本研究结果显示tenascin-W主要表达在螺旋神经节。由于通常在P21至P30小鼠才能形成完整的听觉通路及听觉功能[15]，因此本研究选取P28小鼠SGNs与DAPI共染，显示tenascin-W不与DAPI共定位，与Ⅲ型β-tubulin在SGNs共定位在胞体的胞浆内；RT-qPCR结果显示P7小鼠耳蜗中Tnn mRNA相对量最高，且Western blot法也检测到tenascin-W在P7小鼠耳蜗内的表达。

SGNs是特异的双极神经元及听觉系统的初级神经元，可激发产生动作电位，将毛细胞的听觉信号传至中枢神经系统[15]；SGNs起源于前庭耳蜗神经节，之后在耳蜗前感觉区域发育成熟[16]；最终，SGNs伸出树突与毛细胞基底部形成突触连接，其轴突之间成束形成第Ⅷ对脑神经的听觉部分[17]。本研究证实tenascin-W在小鼠耳蜗中有表达，且在P7小鼠表达量最高，推测该蛋白可能对SGNs的发育及功能具有调节作用。既往研究通过原位杂交证实tenascin-W在小鼠海马体神经元中表达，影响海马体神经元的神经突生长及神经元迁移[1],提示tenascin-W在神经元发育中的潜在作用。因此推测Tnn表达异常或可影响神经元神经突的向外生长及细胞迁移，导致听觉信号的传入受阻，引起听功能受损。

图2 耳蜗冰冻切片荧光染色显示P28小鼠耳蜗的螺旋神经节中tenascin-W与DAPI不共染(×60) 蓝色荧光为DAPI,红色荧光为目的蛋白tenascin-W,control为不加tenascin-W抗体的PBS空白对照。bar=20 μm

图3 耳蜗冰冻切片荧光染色显示P28小鼠耳蜗的螺旋神经节中tenascin-W与Ⅲ型β-tubulin共定位(×60) 蓝色荧光为DAPI,红色荧光为目的蛋白tenascin-W,绿色荧光为Ⅲ型β-tubulin,control为不加tenascin-W抗体的PBS空白对照。bar=20 μm

图4 Western blot检测tenascin-W在P7小鼠内耳的表达 tenascin-W一抗孵育的PVDF膜在180 kDa附近出现蛋白条带,未加入tenascin-W抗体的TBST空白对照在相同位置未出现条带

本研究证实了tenascin-W在各发育阶段小鼠耳蜗中均有表达，且主要定位于SGNs中，推测该蛋白在小鼠SGNs的发育及功能中可能发挥作用，其表达异常可能引起听觉功能受损；但其在听觉系统中的功能及作用机制研究尚无文献报道，通过Tnn基因敲除小鼠模型的构建，对其功能、机制及相关通路可进行更深入的探究,探讨该基因对听功能的影响及相关机制，进一步明确其在听觉系统中的作用。