没食子酸对放射性肺损伤大鼠的保护作用

吴鹏飞 邱立志 张丽丽 白金凤 滕怀远 薛培丽

(四川省科学城医院呼吸与危重症医学科，绵阳市 621000，电子邮箱：461951469@qq.com)

接受胸部放疗的患者中，有50%～100%的患者影像学表现为肺组织受损，有50%～90%的患者存在亚临床的肺功能下降，而多达30%的患者发生有临床症状的肺损伤。由此可见，放射性肺损伤(radiation-induced lung injury，RILI)已成为胸部放疗患者最常见的并发症之一，严重地影响放疗效果及患者生存质量。然而，目前对于RILI仍无有效治疗措施，因此亟须寻找新的治疗手段[1-2]。没食子酸是一种常见的多酚类化合物，来源广泛，易于制取，其生物毒性低，半数致死量高达5 g/kg[3]。其具有较强的抗炎、抗氧化、抗纤维化及促进肿瘤细胞凋亡等作用[4]。研究显示，没食子酸能抑制PM10导致的大鼠心脏组织局部肿瘤坏死因子α、白细胞介素(interleukin,IL)-6升高，并能改善心脏射血分数[5]。因此，没食子酸具有较大的临床应用潜力。目前，有关没食子酸改善RILI的研究报告较为罕见。本研究探讨没食子酸灌胃对RILI大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级SD大鼠36只[成都达硕实验动物公司，批号：SCXK(chuan)2014-189]，雄性，6周龄，体重200 g左右。6只/笼，自由饮水、摄食，光照节律12 h/12 h。

1.2 主要试剂 没食子酸(上海源叶生物科技有限公司，纯度>98%，批号：S30153)，用0.9%氯化钠配制成30 mg/mL的工作液；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染液(武汉博士德生物公司，批号：AR1180)；Masson染液(北京索拉宝科技有限公司，批号：G1340)；大鼠IL-6、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海将来实业股份有限公司，批号：JL20896；JL12342)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：A030-2-1)；兔抗大鼠α 平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体(美国CST公司，批号：19245)；山羊抗兔IgG(上海碧云天公司，批号：A0208)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及RILI大鼠模型的建立：采用随机数字表法将36只大鼠分为对照组、RILI组、RILI+没食子酸组各12只。RILI组、RILI+没食子酸组大鼠参照文献[6]建立RILI模型。4%戊巴比妥(1 mL/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，照射野上界为两侧腋窝中点的连线、下界为剑突下缘平面，铅板遮挡其余部位，6MV-X线直线加速器(美国Varian公司)单次双肺照射，剂量20 Gy，源皮距 100 cm，由放疗科协助完成。对照组不做处理。

1.3.2 干预方法：从照射后第1天开始，RILI+没食子酸组给予2 mL 没食子酸(浓度为30 mg/mL)灌胃，RILI组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，对照组不做任何处理。灌胃持续至照射后第28天。在照射后第4周末及第8周末，每组处死6只大鼠，取血清检测IL-6、TGF-β1水平；取左肺检测肺系数；取部分右肺组织，固定后行HE染色及Masson-Trichrome 染色，观察病理改变，并行免疫组化染色观察α-SMA表达；部分右肺组织，液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，检测羟脯氨酸含量。

1.3.3 肺系数的检测：称体重后处死大鼠，取左肺，生理盐水轻柔漂洗，滤纸吸干表面水分，称重，记为肺湿重，肺系数=肺湿重(mg)/体重(g)×100，用于评估肺水肿程度。

1.3.4 肺组织病理学改变的观察：取部分右肺组织，4%多聚甲醛加压固定72 h，行HE染色、Masson-Trichrome染色，观察病理改变，并采用Szapiel法[7]行肺泡炎评分及纤维化评分。

1.3.5 血清IL-6、TGF-β1水平的检测：经腹主动脉取血3 mL，4℃离心15 min(5 000 r/min)，取上清1 mL，按照ELISA检测试剂盒说明书进行操作，酶标仪(美国热电公司 ，型号：51119770DP)检测450 nm处的吸光度值。

1.3.6 肺组织羟脯氨酸含量的检测：-80℃冰箱取出冻存右肺组织，称取80 mg，按照羟脯氨酸试剂盒说明书操作，碱水法测定肺组织中羟脯氨酸含量，用于评估组织纤维化程度。

1.3.7 肺组织α-SMA表达水平的检测：肺组织石蜡切片常规脱蜡、脱水，3%过氧化氢清除内源性过氧化物酶，柠檬酸盐修复抗原，封闭液封闭，孵一抗，4℃过夜，孵二抗，二氨基联苯胺显色，苏木素轻染，镜下观察肺组织α-SMA表达强度。阳性判断标准：镜下可见棕黄色、褐色区域，则为表达阳性。

1.4 统计学分析 运用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠肺系数比较 在照射后第4周末、第8周末，与对照组比较，RILI组及RILI+没食子酸组大鼠肺系数均增高，而RILI+没食子酸组大鼠肺系数低于RILI组(均P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠不同时间点肺系数比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与RILI组比较，#P<0.05。

2.2 3组大鼠肺组织病理学改变 HE染色显示，对照组大鼠肺泡结构正常，肺泡间隔未见明显细胞渗出；IRLI组大鼠在照射后第4周末可见部分肺泡结构紊乱，腔内见液体渗出，肺泡间隔增宽，细胞渗出增加，在第8周末肺泡炎性改变有所减轻，部分肺泡阻塞、融合，肺泡间隔增宽更加明显，部分区域细胞成分减少；与RILI组比较，RILI+没食子酸组大鼠上述病理改变减轻。RILI组第8周末的肺泡炎评分低于第4周末(t=9.667,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI组与RILI+没食子酸组大鼠肺泡炎评分均高于对照组，而RILI+没食子酸组评分低于RILI组(均P<0.05)。见图1和表2。

Masson-Trichrome 染色显示，对照组大鼠肺组织未见明显蓝色胶原纤维沉积；在照射后第4周末，RILI组大鼠在大气道、大血管附近可见少许蓝色胶原纤维，在第8周时胶原生成及沉积范围增加；与RILI组比较，在各时间点RILI+没食子酸组大鼠的胶原生成减少。RILI组第8周末的纤维化评分高于第4周末(t=9.027,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI组与RILI+没食子酸组大鼠纤维化评分均高于对照组，而RILI+没食子酸组评分低于RILI组(均P<0.05)。见图2和表2。

图1 3组大鼠肺组织HE染色(×200)

图2 3组大鼠肺组织Masson染色(×200)

表2 3组大鼠肺泡炎及纤维化评分比较(x±s,分)

注：与对照组比较，*P<0.05；与RILI组比较，#P<0.05。

2.3 3组大鼠血清IL-6、TGF-β1水平比较 与照射后第4周末比较，第8周末RILI组的血清IL-6水平降低(t=16.133，P<0.001)，而TGF-β1水平升高(t=15.790，P<0.001)。在照射后第4周末及第8周末，RILI组与RILI+没食子酸组血清IL-6及TGF-β1水平均高于对照组，而RILI+没食子酸组血清IL-6及TGF-β1水平均低于RILI组(均P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠不同时间点血清IL-6和TGF-β1水平比较(x±s,pg/mL)

注：与对照组比较，*P<0.05；与RILI组比较，#P<0.05。

2.4 3组大鼠肺组织羟脯氨酸含量比较 RILI组第8周末肺组织中羟脯氨酸含量高于第4周末(t=9.649,P<0.001)；在照射后第4周末及第8周末，RILI组与RILI+没食子酸组肺组织羟脯氨酸含量均高于对照组，而RILI+没食子酸组肺组织羟脯氨酸含量低于RILI组(均P<0.05)。见表4。

表4 3组大鼠不同时间点肺组织羟脯氨酸含量比较(x±s,μg/mg)

注：与对照组比较，*P<0.05；与RILI组比较，#P<0.05。

2.5 3组大鼠肺组织肌成纤维细胞激活情况 在照射后第4周末、第8周末，对照组大鼠肺组织中均未见明显棕黄色阳性表达区域。在照射后第4周末，RILI组肺组织可见α-SMA阳性表达增加，在第8周末阳性表达区域明显增加。在同一时间点与RILI组比较，RILI+没食子酸组肺组织α-SMA阳性表达区域明显减少。见图3。

图3 3组大鼠肺组织α-SMA表达水平(免疫组化染色，×200)

3 讨 论

没食子酸化学名3,4,5，-三羟基苯甲酸，天然存在于绿茶、杧果、葡萄等多种植物内。既往研究显示，没食子酸具有抗炎、抗纤维化等多种功效。例如，Jin等[8]发现，没食子酸可以通过抑制结缔组织生长因子表达及Smad3磷酸化水平，改善心衰诱导的肺纤维化；Nikbakht等[9]在研究博来霉素诱导肺纤维化大鼠模型时发现，给予没食子酸连续灌胃28 d可以显著地降低博来霉素导致的血肿瘤坏死因子 α、IL-1β表达水平。而关于没食子酸对RILI有无保护作用，目前鲜有研究报告。本实验对大鼠双肺进行X线照射以建立RILI模型，照射后大鼠的肺系数、肺泡炎及肺纤维评分均增高，结合肺组织病理改变，符合RILI的表现，提示建模成功。我们进一步使用没食子酸灌胃RILI模型大鼠，以观察没食子酸的干预效果。

RILI是由靶细胞受损后异常修复、细胞因子释放及氧化应激等多方面共同参与的复杂过程，病理上以早期炎症性改变及后期纤维化为特点[10]。持续的炎症反应可以加重肺损伤，促进肺纤维化。IL-6、TGF-β1与RILI发生与发展的关系密切。研究显示，在RILI动物模型及临床RILI患者中，血IL-6、TGF-β1水平均异常增高，且这两项指标具有预测RILI发生风险的作用[11]。IL-6可刺激巨噬细胞、淋巴细胞激活，从而间接增强TGF-β1的促炎、促纤维化能力[6]。TGF-β1能促进成纤维细胞的活化并表达α-SMA，并刺激胶原与纤维结合素生成，导致异常的、大量的细胞外基质蓄积。在RILI早期，TGF-β1水平即明显升高，纤维化后期阶段仍持续高表达，具有很强的促纤维化能力[12]。本实验结果显示，在照射后第4周末，RILI组大鼠血清IL-6、TGF-β1水平明显升高，且第8周末TGF-β1水平继续增高；而经过没食子酸处理后，RILI+没食子酸组大鼠血IL-6、TGF-β1水平以及肺泡炎及肺纤维评分均低于RILI组，肺组织HE染色及Masson染色显示肺组织早期炎症反应及后期纤维化均明显改善。这表明没食子酸能够抑制RILI大鼠全身及局部炎症反应，改善肺组织的纤维化，从而发挥肺保护作用。

激活的成纤维细胞可以“正反馈”刺激成纤维细胞活化，促进TGF-β1等炎性分子分泌，及基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制因子失衡，使得细胞外基质大量生成[13]。而α-SMA表达增加是成纤维细胞增殖的重要标志，抑制α-SMA表达可减少成纤维细胞的激活，从而减轻纤维化。Yue等[14]发现，经照射后猪肺组织中α-SMA表达增加，纤维化程度加重。Cao等[15]发现，虎杖苷能显著地抑制RILI小鼠肺组织中α-SMA的表达，从而减少胶原蛋白沉积。羟脯氨酸在胶原蛋白中特异性表达，因此检测肺组织中羟脯氨酸含量可推测肺纤维化的严重程度。本实验结果显示，在照射后第4周末，RILI组肺组织的α-SMA阳性表达及羟脯氨酸含量均增加，在第8周末进一步增加；而经没食子酸灌胃后，RILI+没食子酸组肺组织α-SMA阳性表达区域明显减少，羟脯氨酸含量降低。这提示没食子酸或通过抑制RILI大鼠肺组织中α-SMA的表达以及减少羟脯氨酸生成，从而发挥抗纤维化作用。

综上所述，没食子酸对RILI大鼠具有肺保护作用，而这可能是通过减轻炎症反应、抑制成纤维细胞激活实现的，其具体机制有待后续进一步研究。