顶空-气相色谱法快速测定食品中甜蜜素的含量

何 浩，吴海智，唐吉旺，朱 礼，袁列江

(湖南省产商品质量监督检验研究院，长沙410007)

甜蜜素，其化学名称为环己基氨基磺酸钠，是食品生产中常用的甜味剂，其甜度是蔗糖的30～40倍。消费者如果经常食用甜蜜素含量超标的食品，就会对人体的肝脏和神经系统造成危害[1]。国家标准GB 2760－2014规定，甜蜜素在饼干、果冻、饮料类中最大使用量为0.65 g·kg－1，在腌制的蔬菜中最大使用量为1.0 g·kg－1，在面包、糕点中最大使用量为1.6 g·kg－1，在凉果类、话化类中最大使用量为8.0 g·kg－1。

食用槟榔作为湖南、海南等地的地方性特色食品，湖南省地方标准DB 43/132－2004和海南省地方标准DB46/T 75－2007中均明确规定其甜蜜素含量限值为8.0 g·kg－1。

目前，食品中甜蜜素的测定方法有自动液体进样-气相色谱法[2]、顶空-气相色谱法[3-5]、比色法[6]、气相色谱-质谱法[7-8]、液相色谱法[9]、液相色谱-质谱法[10]和离子色谱法[11]等。

液体进样-气相色谱法和气相色谱-质谱法需要冰浴衍生化反应等较繁琐的步骤，且衍生化产物为环己醇亚硝酸酯和环己醇的混合物，随着时间的推移，环己醇亚硝酸酯会逐步转化为环己醇，对定量造成影响。比色法的检出限较高，不适用于微量甜蜜素的测定。液相色谱法也需经过衍生化反应和液液萃取等步骤，且液相色谱法分离度比气相色谱法差，容易造成假阳性结果。液相色谱-质谱法的前处理简单，但只适合于白酒等基质简单的样品，且该仪器昂贵，不利于方法的普及。离子色谱法对基质的除杂要求较高，过程繁琐，且容易造成回收率偏低。因此，找到一种前处理简单、定量准确并适用于各种复杂食品基质的测定甜蜜素含量的方法是非常有必要的。本工作对样品前处理步骤进行了优化，采用顶空-气相色谱-质谱法对衍生化产物进行定性，并推断反应的机理;以甜蜜素的主要衍生化产物环己烯为目标待测物，建立了顶空-气相色谱法测定食品中甜蜜素含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

HSS86.50 Plus型顶空进样器;GC 2010Plus型气相色谱仪，配火焰离子化检测器(FID);SPB-3型全自动空气源;SPH-300 型空气发生器;7697A-7890A-5975C 型 顶 空-气 相 色 谱-质 谱 联 用 仪，配NIST 11谱库;ATY224型电子天平;KQ-500VDV型超声波清洗器;DC 2020型低温恒温槽。

甜蜜素标准储备溶液:称取0.100 0 g甜蜜素标准品，加入50 m L水，超声溶解后，移入100 m L 棕色容量瓶中，定容摇匀，配制成1.000 g·L－1的标准储备溶液。

甜蜜素标准溶液:移取25.0 m L 甜蜜素标准储备溶液至250 m L 棕色容量瓶中，用水定容，摇匀，配制成100 mg·L－1的标准溶液。

甜蜜素标准品纯度为99.1%，亚硝酸钠和硫酸均为分析纯;高纯氮气纯度不小于99.999%，高纯氦气纯度不小于99.999%;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)顶空条件 加热箱温度50 ℃;定量环温度55 ℃;传输线温度60 ℃;循环时间13.0 min;平衡时间30 min;定量阀体积1.0 m L。

2)气相色谱条件 DB-1 石英毛细管色谱柱(15.0 m×0.53 mm，0.50 μm)，色 谱 柱 流 量1.99 m L·min－1;气 化 室 温 度150 ℃，FID 温 度300 ℃;载气为氮气;氢气流量40.0 m L·min－1，空气流量400.0 m L·min－1，尾吹气流量30.0 m L·min－1;分流进样，分流比为20∶1。柱升温程序:初始温度为80 ℃，保持1 min;以40 ℃·min－1速率升温至100 ℃，保持2 min;再以40 ℃·min－1速率升温至200 ℃，保持2 min，共8 min。

3)气相色谱-质谱条件 DB-5MS石英毛细管柱(0.32 mm×30 m，0.25 μm);色 谱 柱 流 量1.0 m L·min－1;气化室温度150 ℃;载气为氦气;分流进样，分流比为100∶1。柱升温程序:初始温度为80 ℃，保持1 min;以25 ℃·min－1速率升温至155 ℃，保持6 min，共10 min。电子轰击离子源(EI)，EI 能 量70 e V;气 相 色 谱-质 谱 接 口 温 度280 ℃，离子源温度230 ℃，四 极 杆 温 度150 ℃;溶剂延迟时间0 min;扫描方式为全扫描;扫描质荷比m/z30～250。

1.3 试验方法

称取粉碎均匀的固体样品或液体样品(包括含酒精的饮料)10.000 0 g，放入100 m L 带刻度的比色管中，加水至90 m L，固体样品超声提取1 h，含二氧化碳液体样品超声提取10 min，冷却后用水定容，摇匀。凉果类、话化类食品和食用槟榔的提取液需稀释20倍后才可使用，其他样品提取液均可直接使用。移取10.0 m L 样品提取液至20 m L 顶空进样瓶中，再依次加入100 g·L－1硫酸溶液1.0 m L和100 g·L－1亚硝酸钠溶液1.0 m L，封盖后振荡摇匀，按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 试验方法探究

国家标准GB 5009.97－2016第一法规定了测定甜蜜素的方法:甜蜜素在硫酸介质中与亚硝酸发生反应，利用反应生成的环己醇亚硝酸酯进行气相色谱定性和定量分析;由于此方法衍生化过程中加入了氯化钠，导致反应产物较为复杂，此时氯化钠不再发挥盐析作用，而是作为反应物生成了各种氯代产物，如氯代环己烷、2-氯环己醇、顺式1，2-二氯环己醇、反式1，2-二氯环己醇等[12]。文献[7]采用顶空-气相色谱法研究了甜蜜素，并将其作为定量物质时发现，NIST11 检索库中无该物质信息。本工作在上述工作基础上，在亚硝酸盐的冷溶液中加入强酸，生成的亚硝酸与环己基氨基磺酸发生重氮化反应，期望利用其生成环己烯[13]对甜蜜素进行顶空-气相色谱法定量分析。

2.2 色谱行为

将甜蜜素标准品和空白样品按试验方法进行气相色谱测定，甜蜜素标准品衍生物的色谱图见图1，通过和空白样品色谱图比较得出，甜蜜素衍生产物的保留时间为1.73 min。取甜蜜素标准品衍生后溶液，在气相色谱-质谱条件下进行分析，所得质谱图见图2。将该质谱图与NIST11 谱库比对，确定该衍生产物为环己烯，其保留时间为1.64 min。

图1 甜蜜素衍生物的气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of cyclamate derivative

图2 甜蜜素衍生物的质谱图Fig.2 Mass spectrum of cyclamate derivative

2.3 提取方法的选择

试验分别采用超声、煮沸两种方式对样品进行了提取。超声提取步骤见试验方法;煮沸提取是将装有样品的比色管放入100℃水浴锅中加热1 h，其他步骤同超声提取方法的一致。两种方法的比对结果见表1。

由表1可知:超声提取与煮沸提取结果无显著差异，但得考虑前者的操作更便捷，试验采用超声提取方法。

2.4 顶空平衡条件的选择

平衡时间的选择，既要保证目标物质能从液相中充分逸散到气相中，又要避免目标物质的分解和反应导致的目标产物含量降低。试验选择在50 ℃下 平 衡5，10，20，30，42，54，66，78，90，102，114，126，138，180，210，240，300 min后进样，结果表明:环己烯峰面积随着平衡时间的延长呈逐步下降趋势，且100 min后峰面积已减小到原来的80%，为保证定量结果的准确性，应保证样品在重氮化反应后100 min内完成测定。试验选择顶空平衡时间为30 min。

表1 超声提取与煮沸提取结果对比(n＝6)Tab.1 Comparison of results obtained by ultrasonic extraction and boiling extraction(n＝6)

同时，当顶空进样器和气相色谱连续进样50次以上未维护时，环己烯的峰形变差，响应值下降明显。应在连续进样30次后，将顶空进样器的炉子、定量环和传输线在130 ℃老化1 h以上，将色谱柱在最高耐受温度下老化0.5～1 h，以保证定量结果的重现性。

2.5 标准曲线、检出限和测定下限

分别向5个顶空瓶中加入100 mg·L－1甜蜜素标准溶液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 m L，用水定容至10.0 m L，按试验方法在色谱条件下进行测定。以甜蜜素标准品取样量(mg)为横坐标，以环己烯峰面积(μV·s－1)为纵坐标绘制标准曲线，甜蜜素标准品取样量在0.000 01～5 mg内呈线性关系，线性回归方程为y＝4.074×105x＋2.492×104，相关系数为0.999 9。

加入0.000 1 mg甜蜜素标准品，按试验方法重复测定12次，以3倍信噪比计算方法检出限(3S/N)为0.4 mg·kg－1，以10倍信噪比计算方法测定下限(10S/N)为1.3 mg·kg－1，而国家标准GB 5009.97－2016第一法中甜蜜素检出限为10 mg·kg－1，本方法检出限比国家标准方法的低。这是因为顶空法中环己烯主要集中在顶空瓶上方10 m L的空间，而定量阀体积为1.0 m L，相当于千分之一的环己烯进入气相色谱仪;在国家标准GB 5009.97－2016第一法中，提取溶剂正己烷体积为10.0 m L，进样量仅1.0μL，相当于万分之一进入气相色谱仪。因此，本法比国家标准方法检出限低。除此之外，本方法还可以通过降低分流比进一步降低检出限。

2.6 回收试验

分别对雪碧样品和鸡蛋卷样品进行3个浓度水平的6次平行加标回收试验，计算回收率，结果见表2。回收率符合国家标准GB/T 27404－2008《实验室质量控制规范 食品理化检验》附录F要求。

表2 本方法与国家标准方法回收率比对(n＝6)Tab.2 Comparison of recovery of this method and national standard method(n＝6)

2.7 方法比对

采用本方法和国家标准GB 5009.97－2016第一法分别对鸡蛋卷等9种不同样品进行分析，平行测定6次，结果见表3。两种方法相对偏差的绝对值均小于4.0%，检测结果无显著差异。

表3 本方法与国家标准方法检验结果的对比(n＝6)Tab.3 Comparison of results of this method and national standard method(n＝6)

本工作采用顶空-气相色谱-质谱法对甜蜜素衍生化产物进行定性，确定该衍生化产物为环己烯。并在国家标准GB 5009.97－2016第一法基础上优化了前处理步骤，分析了甜蜜素衍生物峰面积与样品平衡时间的关系曲线，得到样品的最优平衡时间为30 min。建立了顶空-气相色谱法测定食品中甜蜜素含量的方法。本方法的检出限和回收率均符合国家标准GB/T 27404－2008《实验室质量控制规范 食品理化检验》附录F要求。