反相高效液相色谱法结合计时波长切换紫外检测法测定苯妥英及其中间体的含量

朱爱龄，倪貌貌，宋亚萍，谭志文，俞 超，汪财生，张凯龙

(浙江万里学院 生物与环境学院，宁波315100)

苯妥英钠，又名大仑丁钠，化学名为5，5-二苯基-2，4-咪唑烷二酮钠盐，是乙内酰脲类抗癫痫药物，常用于抗心律失常、抗三叉神经痛和抗轻度高血压等[1]，由前体苯妥英(Ⅲ)与对应的化学计量比的氢氧化钠成盐制得[2]。前体苯妥英的合成过程是一个多步反应，先由苯甲醛缩合合成安息香(Ⅰ)，经氧化生成苯偶酰(Ⅱ)，再与尿素缩合得到，具体流程见图1。

安息香氧化是制备苯偶酰的主要方式，也是苯妥英合成的关键步骤，传统一次性计量氧化剂消耗量大、污染严重[3-5]，随着近年来绿色化学和循环经济的兴起，各类绿色氧化剂如过氧化氢、臭氧、氧气、空气引起了关注。在催化空气氧化反应领域，安息香氧化已被作为模式反应广泛用于催化剂性能的评价[6-9]。

图1 安息香氧化制备苯偶酰及苯妥英Fig.1 Preparation of benzil and phenytoin by oxidation of benzoin

在苯妥英制备过程中，需要对苯妥英纯度及低浓度苯偶酰、安息香等残留量进行测定。本工作建立了反相高效液相色谱法结合计时波长切换紫外检测法同时测定苯妥英及其中间体苯偶酰、安息香的含量，方法简单快捷、灵敏高效，可为苯妥英制备方法开发及相关产品检测提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1201型高效液相色谱仪，配UV 1201 型紫外检测器、P 1201型二元高压泵;UV 2600型紫外-可见分光光度计;Milli-Q Integral 5 型超纯水系统;ME104E型分析天平。

安息香、苯偶酰和苯妥英的单标准储备溶液:1 000 mg·L－1，分别称取安息香、苯偶酰和苯妥英100 mg，用乙腈溶解定容至100.0 m L，于4 ℃冷藏备用。使用时用乙腈稀释至所需质量浓度。

安息香(纯度不小于99.5%)、苯偶酰(纯度不小于98%)和苯妥英(纯度不小于99%)等标准品;甲醇和乙腈均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

kromasil 100-5C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5μm);进样量20μL;柱温30 ℃;流动相为体积比为80∶20 的乙腈-水溶液;等度洗脱，流量为1.0 m L·min－1。计时波长切换程序:0～3.0 min时，检测波长为218 nm;3.0～4.0 min时，检测波长为247 nm;4.0～6.0 min时，检测波长为260 nm;根据保留时间定性，峰面积外标法定量。

1.3 试验方法

以盐酸酸化的二甲亚砜为溶剂，铁盐催化空气氧化安息香制备苯偶酰，苯偶酰与尿素缩合制备苯妥英。称取100 mg合成样品，用乙腈溶解并定容至100.0 m L，稀释50倍后，经过0.45μm 滤膜过滤，得到滤液，按照仪器工作条件进行测定，同时进行杂质含量分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对安息香、苯偶酰和苯妥英的混合标准溶液进行测定，色谱图见图2。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 检测波长

以乙腈为参比，用紫外-可见分光光度计在200～400 nm 内对安息香、苯偶酰和苯妥英进行扫描，结果见图3。

由图3可知:苯偶酰、安息香和苯妥英的最大吸收波长分别为260，247，218 nm，安息香和苯偶酰的最大吸收波长比较接近，但与苯妥英的最大吸收波长相差较远，三者在205 nm 处均具有较强吸收，同

图2 混合标准溶液的色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution

图3 苯偶酰、安息香和苯妥英的紫外吸收光谱图Fig.3 UV absorption spectra of benzil，benzoin and phenytoin

时流动相在该波长下吸收也较强，杂质干扰也较多，并且低波段光源稳定性低，基线漂移较大。综合考虑，采用计时波长切换紫外检测法不仅可以测定产物主成分含量，而且可以兼顾低含量的残留杂质的高灵敏度检测[10-14]。

2.2.2 流动相的组成及其流量

试验考察了分别以甲醇-水溶液和乙腈-水溶液为流动相进行等度洗脱时，对苯妥英、安息香和苯偶酰分离效果的影响。结果表明:以甲醇-水溶液为流动相时，分析时间较长，且色谱图存在拖尾现象;以乙腈-水溶液为流动相时，色谱峰的峰形良好，且分析时间显著缩短。试验选择的流动相为乙腈-水溶液。

试验进一步考察了分别以体积比为60∶40的乙腈-水溶液、体积比为70∶30的乙腈-水溶液和体积比为80∶20的乙腈-水溶液为流动相时，对苯妥英、安息香、苯偶酰分离效果的影响，结果见图4。

图4 不同组成的流动相条件下混合标准溶液的色谱图Fig.4 Chromatograms of mixed standard solution with different mixing ratios mobile phases

由图4可知:当流动相中乙腈比例较低时，流动相的洗脱能力较弱，各物质的色谱峰保留时间较长，且以体积比为60∶40的乙腈-水溶液为流动相时，色谱峰出现一定程度的拓宽和变形;随着流动相中乙腈比例的增大，各物质的色谱峰保留时间减少，当以体积比为80∶20的乙腈-水溶液为流动相时，苯妥英、安息香、苯偶酰的相邻色谱峰分离度分别为1.88，3.95，均大于1.5，实现了三组分的完全分离。试验选择的流动相为体积比为80∶20 的乙腈-水溶液。

试验进一步考察了流动相为体积比为80∶20的乙腈-水溶液的流量分别为0.8，1.0，1.2 m L·min－1时，对苯妥英、安息香和苯偶酰分离效果的影响，结果见图5。

图5 体积比为80∶20的乙腈-水溶液在不同流量条件下混合标准溶液的色谱图Fig.5 Chromatograms of mixed standard solution with different flow rates of acetonitrile-water solution with the volume ratio of 80∶20

由图5可知:当流动相为体积比为80∶20的乙腈-水溶液的流量为0.8 m L·min－1时，苯妥英、安息香和苯偶酰可实现完全分离，但分析时间较长;当流动相为体积比80∶20 的乙腈-水溶液的流量为1.2 m L·min－1时，苯妥英和安息香的色谱峰较为接近，不利于较高浓度的苯妥英和安息香的完全分离。综合考虑，试验选择流动相为体积比为80∶20的乙腈-水溶液的流量为1.0 m L·min－1。

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

用乙腈将安息香、苯偶酰和苯妥英的混合标准溶 液 稀 释 为0.1，0.5，1，5，10，20，40，60，80，100 mg·L－1的混合标准溶液系列，按照仪器工作条件对其测定。以安息香、苯偶酰和苯妥英的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。安息香、苯偶酰和苯妥英的质量浓度均在0.1～100 mg·L－1内与其对应的峰面积之间呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表1。

以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收试验

对实际样品进行低、中、高等3种水平的加标回收试验，每个加标样品平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2 可知:安息香的回收率为98.0%～99.0%，RSD 为2.0%～4.2%;苯偶酰的回收率为97.2%～105%，RSD 为2.3%～2.7%;苯妥英的回收率为95.4%～99.5%，RSD 为1.8%～2.1%。回收率高，方法准确，可满足分析要求。

本工作建立了反相高效液相色谱法结合计时波长切换紫外检测法测定安息香、苯偶酰和苯妥英含量的分析方法。方法分析快速、灵敏度高、重现性好，适用于催化氧化安息香模式反应研究，可适用于苯偶酰及苯妥英生产制备过程中的测定及残留量分析。