固相萃取柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定助眠类保健品中22种禁用安神类药物的含量

钟世欢，金建奇，叶磊海，，叶佳明，王 潇，裘钧陶

(1.赞宇科技集团股份有限公司，杭州310009; 2.浙江金正检测有限公司，义乌321000;3.浙江公正检验中心有限公司，杭州310009)

失眠是一种常见的睡眠障碍症，患者常常因睡眠时间、质量不满足而影响日间社会功能。长期失眠会导致工作效率降低，社会成本增加[1]，甚至引发心脏病、高血压等心脑血管疾病[2-4]，对人类的生理和心理产生极大的伤害。部分失眠患者为缓解失眠症状，会选择助眠类保健品进行辅助治疗，认为其具有效果温和、不良反应小等优点。但个别不法商家为了牟取暴利，将禁用安神类药物添加至保健品中，以增强药效。这些非法添加的化学药物使患者产生依赖性，大量使用会引发相应的毒副作用，抑制患者的中枢神经[5]，影响其认知能力[6]。在患者不知情下使用，容易引发和其他物质相互作用[7]，甚至中毒，严重危害患者生命安全。因此，国家对禁用安神类药物的添加量进行了严格的规定，在保健品中禁止添加。

目前，国家食品药品监督管理局在“药品检验补充检验方法和检验项目批准件(2009024、2013002和2012004)”中提出了禁用安神类药物的测定方法，包括薄层色谱法和液相色谱法，该方法涉及色谱体系较多，分析时间长，样品的提取过程较繁琐，无法同时快速测定多种禁用安神类药物的含量。国内外报道的关于禁用安神类药物的测定方法主要有高效液相色谱法[8]、数字对照品法[9]、薄层色谱法[10]、高效液相色谱-串联质谱法[11-14]及气相色谱-串联质谱法[15]等，但是同时测定保健品中22种禁用安神类药物的分析方法较少。

本工作建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定助眠类保健品中22种禁用安神类药物的含量，该方法具有快速、准确和简便等优点，可用于指导实际工作，可为助眠类保健品的风险评估提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

AB 4500型超高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾离子源和Analyst数据处理系统;AR 2140型电子分析天平;KS-300EI型超声波清洗器;Centrifug-5804R 型台式离心机;N-EVAP 11 型氮吹仪;Milli-Q 型纯水仪;Oasis PRi ME HLB固相萃取柱(200 mg/6 m L)。

22 种禁用安神类药物的单标准储备溶液:1 000 mg·L－1，分别称取各禁用安神类药物标准品0.010 0 g，用甲醇溶解并转移至10 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，于－20 ℃下避光保存。

22 种禁用安神类药物标准品，纯度均大于98%;乙腈、甲酸和甲醇均为色谱纯;试验用水为超纯水。

试验选择的助眠类保健品均由流通市场上随机抽样得到。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm);流量为0.30 m L·min－1;进样量2.0μL;柱温35 ℃;流动相A 为含0.05%(体积分数，下同)甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序:0～0.5 min时，B为5%;0.5～5.0 min时，B 由5%升至90%;5.1～9.0 min时，B为90%;9.1～12.0 min时，B为5%。

2)质谱条件 电喷雾离子源(ESI)，正离子(ESI＋)和负离子(ESI－)扫描模式同时采集;多反应监测模式;离子源温度500 ℃;气帘气压力278.5 k Pa，喷雾气压力69.0 k Pa，辅助加热气压力379.2 k Pa。22 种禁用安神类药物的质谱参数见表1，其中“∗”为定量离子。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

1.3 试验方法

称取样品1.000 g，用甲醇溶解并转移至25 m L容量瓶中，涡旋混匀，超声15 min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，混合摇匀，离心，取上清液5.00 m L经过Oasis PRi ME HLB 固相萃取柱，收集流出液，用甲醇2 m L淋洗固相萃取柱2次，合并收集的流出液，于40 ℃下吹氮浓缩至近干，再用体积比为1∶1的0.05%甲酸-甲醇混合溶液1.00 m L重复溶解残渣，经过0.22μm 滤膜过滤，得到的滤液按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

2.1.1 提取剂

部分不法厂商将禁用药物掺杂在片剂包衣或胶囊壳中，以逃避抽查检测，试验将样品连同片剂包衣和胶囊壳一起研碎后取样。22种禁用安神类药物的物理、化学性质不同，试验考察了分别以甲醇、乙醇和乙腈为提取剂时，对胶囊类、口服液类、片剂类保健品中22 种禁用安神类药物提取效率的影响。结果表明:甲醇、乙醇和乙腈提取剂对口服液类保健品中22种禁用安神类药物的提取效率相当;胶囊类和片剂类保健品富含天然产物、蛋白质与脂肪类化合物，用乙醇提取时，基质干扰物较多，受基质抑制效应的影响严重，而用甲醇、乙腈提取胶囊类保健品和片剂类保健品时基质影响较乙醇小。考虑到甲醇比乙腈更安全经济，试验选择的提取剂为甲醇。

2.1.2 固相萃取柱

为了进一步减小基质干扰，试验比较了C18固相萃取柱、DisQu E净化粉及Oasis PRi ME HLB固相萃取柱对22种禁用安神类药物的净化效果，结果见图1。

图1 不同种类的固相萃取柱对22种禁用安神类药物净化效率的比较Fig.1 Comparison of efficiency of purification of the 22 forbidden sedative-hypnotics by different kinds of solid phase extraction columns

由图1可知:Oasis PRi ME HLB固相萃取柱对22种禁用安神类药物的净化效果最好，可有效降低基质效应。试验选择Oasis PRi ME HLB固相萃取柱对样品进行净化。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱

试验考察了Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm)和RSLC 120 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.2μm)对22种禁用安神类药物测定的影响。结果表明:这2种色谱柱对22种禁用安神类药物的分离效果相当，且在基线噪声方面没有太大差别，但Poroshell 120 EC-C18色谱柱(50 mm×3.0 mm，2.7μm)的系统压力较小，试验选 择Poroshell 120 EC-C18色 谱 柱(50 mm ×3.0 mm，2.7μm)对22 种 禁 用 安 神 类 药 物 进 行分离。

2.2.2 流动相

试验考察了分别以0.1%甲酸溶液、含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液为流动相A 时对22种禁用安神类药物分离效果的影响。结果表明:流动相中加入甲酸溶液可增加离子化效率，使信号响应强度增强;乙酸铵调节流动相的酸度且具有缓冲作用，可防止色谱峰出现拖尾现象，有效改善峰形，其中对巴比妥类禁用安神类药物的出峰情况改善最为明显。试验选择的流动相A 为含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液。以含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液为流动相A 时，巴比妥类禁用安神类药物的总离子流色谱图见图2。

试验进一步考察了分别以乙腈、甲醇为流动相B对22种禁用安神类药物测定的影响。结果发现:以甲醇为流动相B时，22种禁用安神类药物的峰形扁平甚至分叉，且分离度较差;以乙腈为流动相B时，基线平稳且22种禁用安神类药物的峰形良好。综合考虑，试验选择的流动相为含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸铵溶液-乙腈混合溶液。

图2 4种禁用安神类药物的总离子流色谱图Fig.2 Total ion flow chromatogram of 4 forbidden sedative-hypnotics

2.3 质谱条件的选择

配制5 mg·L－1的22种禁用安神类药物的标准溶液，用针泵取样后，在手动调节模式下，通过针泵以10μL·min－1的流量进样来确定母离子;再通过手动调节去簇电压值，使母离子的信号强度只有最强碎片离子信号强度的三分之一左右，选择两个最强的碎片离子作为子离子;再优化碰撞电压，提供离子共振能量，有效防止溶剂分子吸附从而实现去簇，同时预防离子共振碎裂导致源内裂解;最后对离子源温度、气帘气压力、喷雾气压力和辅助加热气压力等参数进行优化，使目标物的响应信号达到较大。在ESI＋模式下18 种禁用安神类药物的色谱图见图3，在ESI－模式下4种巴比妥类禁用安神类药物的色谱图见图2。

图3 18种禁用安神类药物的总离子流色谱图Fig.3 Total ion flow chromatogram of 18 forbidden sedative-hypnotics

在巴比妥类禁用安神类药物的质谱条件优化时，发现均有质荷比(m/z)为85 碎片离子，根据4种巴比妥类化合物结构式及碎片信息推测，其断裂方式见图4。

图4 禁用安神类药物的裂解方式Fig.4 The cracking mode of the forbidden sedative-hypnotics

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件对22种禁用安神类药物的混合标准溶液系列进行测定，以22种禁用安神类药物的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。22种禁用安神类药物的线性范围、线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表2(续)

以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果见表2。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对空白胶囊类、片剂类和口服液类保健品样品进行加标回收试验，加标量为3，10，100倍的检出限，每个加标样品平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。结果表明:22 种禁用安神类药物的回收率为81.2%～98.9%，RSD 为3.1%～9.7%。

2.6 样品分析

按照试验方法对市场上流通销售的胶囊类、片剂类和口服液类等30 种助眠类保健品进行测定。结果表明:有1种样品中检出褪黑素，质量分数为2.10 mg·g－1。国家标准GB/T 5009.170－2003中关于保健品中褪黑素的测定方法为高效液相色谱-紫外检测法，采用该方法对该阳性样品进行测定，褪黑素的质量分数为2.15 mg·g－1，说明本工作建立的方法准确可行。

本工作建立了UPLC-MS/MS同时测定助眠类保健品中22种禁用安神药物的分析方法。优化了前处理方法和仪器工作条件，减少了前处理时间及成本，避免了复杂前处理过程导致的目标物损失。该方法具有快速、灵敏度高、专属性强等优点。针对目前助眠类保健品种类繁多，市场情况复杂的情况，可用于实际检测工作，实现样品中各种禁用安神类药物的快速分析筛查，可为助眠类保健品安全突发事件的快速处理工作提供技术支持。