气相色谱-串联质谱法测定蔬菜和水果中三氯生及甲基三氯生的含量

王 帅，史永富

(1.安徽省临泉县农产品质量安全检测站，临泉236400;2.中国水产科学研究院 东海水产研究所 农业农村部水产品质量监督检验测试中心(上海)，上海200090)

三氯生(TCS)是家庭厨卫和个人护理产品(PPCPs)中常用的抗菌剂。2016 年美国和欧盟国家均已禁止TCS作为抗菌剂应用于洗护产品中，含有TCS的药物和PPCPs通过人们正常的生活使用，该类物质随着生活污水持续排放到水生环境中，导致其广泛分布并稳定存在于地表、污水、污泥、水体以及底泥中，被认为是新兴污染物[1-3]。甲基三氯生(MTCS)是TCS在环境中通过微生物甲基化转化生成的降解产物[4]，MTCS比TCS具有更强的亲脂性、持久性和毒性，可在更广的范围内进行生物积累和分布[5-6]。TCS也可通过氯化反应和光化学反应生成氯化酚和二噁英[7]，还可与水体中的游离氯或氯胺反应生成三氯甲烷和其他毒性衍生物[8]。TCS作为具有抗菌活性的醚类，在生物体内表现出中等程度的内分泌干扰、氧化应激以及神经毒性，能够破坏包括鱼类、两栖动物和哺乳动物在内的多个物种的内分泌功能，引起多个物种的生长、发育、繁殖以及组织器官功能损伤，甚至导致畸形和癌症等[8-11]。MTCS比TCS的脂溶性更强，生物积累性更加持久，多数情况下比TCS 在水生生物中更常见，能够产生更强的毒性作用[12-14]。当以含有TCS和MTCS的沉积物作为肥料施于农田土壤中[15]，或使用污染农田周边的水体灌溉农田和果园，或农田靠近污水处理厂，以上情况均增加了TCS 和MTCS引入蔬菜和水果中的风险，进而通过食物链传递影响消费者的健康。

TCS和MTCS的检测一般采用气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LCMS/MS)[16-19]，使用GC-MS/MS 一般需要对TCS进行衍生化反应，使其转化为弱极性衍生物以便于检测[15]。目前，国内关于蔬菜和水果中TCS 和MTCS的研究报道较少，本工作建立了GC-MS/MS测定蔬菜和水果中TCS和MTCS的含量，有助于认识TCS在环境中的转化传递行为，初步研究了TCS和MTCS在蔬菜和水果中的污染问题，可对农产品质量安全进行风险评估，对农产品质量安全监测具有十分重要的意义和应用前景。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo TSQ Quantum 型气相色谱-串联质谱仪;XYC-BDM-24 型氮吹仪;LG100B 型理化干燥箱;Hitachi∗RX 型高速冷冻离心机;B5510E-MT型超声波清洗机;JA12002型电子天平;Talboys数显型旋涡混合器;BUCHI R-100 型旋转蒸发仪;DMT-2500型多管旋涡混合仪。

TCS标准储备溶液:100 mg·L－1，称取5.0 mg TCS标准品，用甲醇溶解并转移至50 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀，密封，于4 ℃下保存。

MTCS标准储备溶液:100 mg·L－1，称取5.0 mg MTCS标准品，用甲醇溶解并转移至50 m L棕色容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀，密封，于4℃下保存。

混合标准溶液系列:移取三氯生标准储备溶液和甲基三氯生标准储备溶液适量，用甲醇将其稀释为0.4，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg·L－1的 混 合 标 准溶液系列，密封，于4 ℃下保存。

TCS(纯度为99.5%)和MTCS(纯度为98.9%)标准品;衍生试剂为体积比为99∶1的N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液;乙酸乙酯和甲醇均为色谱纯。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 DB-17MS 毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);进样口温度为280℃;进样体积为1μL;不分流进样;载气为氦气(纯度为99.999%)，流量为1.4 m L·min－1。柱升温程序:初始温度为150 ℃，保持1 min;以25 ℃·min－1的速率升温至250 ℃;再以5 ℃·min－1的速率升温至260 ℃;最 后 以30 ℃·min－1的 速 率 升 温 至290 ℃，保持1 min;总运行时间9 min。

2)质谱条件 电子轰击离子源(EI);离子源温度为250 ℃;电离能量为70 e V;多反应监测(MRM)模式;传输线温度为250 ℃;溶剂延迟3 min。

1.3 试验方法

试验以西红柿、黄瓜、橙子和苹果为样品，将西红柿、黄瓜和苹果分别切块，橙子去皮后切块，匀浆，于－22 ℃下储藏备用。分别称取各样品5.00 g于30 m L具塞塑料离心管中，加入10 m L 乙酸乙酯，在多管旋涡混合仪中以2 500 r·min－1的转速匀浆2 min，超声提取10 min，再以10 000 r·min－1的转速离心10 min，将上层有机相转至鸡心瓶中，下层残渣再用10 m L乙酸乙酯重复提取一次，合并2次提取液至鸡心瓶中。将鸡心瓶中的提取液旋转蒸发至近干，用2 m L 乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，重复洗涤2次，收集洗涤液于10 m L具塞玻璃离心管中，吹氮至近干。向吹干的具塞玻璃离心管中加入100μL体积比为99∶1的N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷混合溶液进行硅烷化衍生化反应，在60 ℃下衍生40 min，衍生结束后，吹氮至近干。用1.0 m L乙酸乙酯溶解残渣[20]，得到待测液，按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

TCS结构中含有酚羟基，具有一定的极性，使其在进样口灵敏性较低，在色谱柱中反应性较高，导致其色谱峰容易产生拖尾现象，影响测定结果的准确度[21]。同时，MTCS是TCS在环境中的甲基化转化产物，必须避免使用甲基化试剂(如重氮甲烷)进行衍生化反应。试验采用硅烷化衍生试剂[20]对TCS进行改性，硅烷基(Si(CH3)3－)取代TCS中酚羟基中的H，使其转化为弱极性稳定存在的TCS硅烷化衍生物，以改善色谱峰形和测定结果的准确度。TCS硅烷化衍生化反应见图1。

用氮气将衍生化反应的残留物吹干后，形成的白色结晶物在正己烷中的溶解度较小，试验选择极性更高的非质子溶液乙酸乙酯对残渣进行溶解[15]。同时，以乙酸乙酯作为提取溶液，降低前处理过程中试剂转换带来的干扰效应，提高方法的兼容性。一般情况下，样品在经过提取、浓缩过程后，会对样品进行净化处理，例如采用盐酸-高氯酸溶液去除蛋白质[22-23]，凝胶渗透色谱(GPC)-硫酸溶液去除脂肪[23-24]，固相萃取(SPE)柱净化去除共同提取的极性干扰物[25-26]等。水产品和畜产品中因含有较多的脂肪和蛋白质需经过净化处理后再进行分析，但蔬菜和水果基质成分相对简单，经证实方法的准确度和精密度能够满足分析要求，试验选择样品在经过提取、浓缩过程后无需再进行净化处理。

图1 TCS硅烷化衍生化反应Fig.1 Silylation derivation reaction of TCS

2.2 三氯生和甲基三氯生的定性鉴别

2.2.1 全扫描模式

试验对TCS衍生物和MTCS进行一级质谱全扫描，质荷比(m/z)扫描范围为50～500，在电离能量为70 eV 的轰击下，扫描得到TCS 衍生物和MTCS的全扫描一级质谱图，以确定其分子离子和碎片离子的质荷比m/z。

为了确保对目标物鉴定的专属性，以TCS衍生物和MTCS的分子离子为母离子进行二级质谱全扫描，进一步确定与母离子对应的特征子离子。TCS衍生物和MTCS的一级质谱全扫描质谱图以及二级质谱图见图2～4。

图2 TCS衍生物的全扫描一级质谱图和其衍生物碎片m/z 362的二级质谱图Fig.2 Full scanning MS spectrum of derivate of TCS and MS2 spectrum of its derivate fragment at m/z 362

图3 TCS衍生物的全扫描一级质谱图和其衍生物碎片m/z 360的二级质谱图Fig.3 Full scanning MS spectrum of derivate of TCS and MS2 spectrum of its derivate fragment at m/z 360

由图2(a)可知:TCS衍生物经过一级质谱全扫描后确定分子离子为m/z361.88，但在一级质谱重复性试验过程发现其分子离子也出现m/z360.24的情况，如图3(a)所示，这可能与衍生化反应或者同位素的存在有关，但两种情况下，离子丰度最高的离子质荷比m/z均为347，即TCS衍生物裂解失去甲基所得。MTCS 的全扫描一级质谱图确定分子离子为m/z304，丰度最高的离子为m/z304.23，如图4(a)所示，即MTCS失去一个氯和一个甲基所得。

图4 MTCS的全扫描一级质谱图和特征碎片的二级质谱图Fig.4 Full scanning MS spectrum of MTCS and the MS2 spectrum of characteristic fragment

将m/z361.88，304.23 分 别 对 应 的TCS 衍 生物和MTCS的母离子进行二级质谱全扫描后，得到对应的丰度最高的子离子分别为m/z347.46，254.32，如图2(b)和图4(b)所示。TCS衍生物母离子为m/z360.24 时，得到的丰度最高的子离子为m/z344.99，见图3(b)。

2.2.2 多反应监测模式

MRM 模式下，质量分析器1扫描得到TCS衍生物和MTCS的母离子，给予碰撞解离电压10 V，在碰撞室内碰撞解离，质量分析器2扫描得出与之对应的子离子，经过这样两次选择，可以得到属于目标物的特征离子对。鉴于TCS衍生物全扫描一级质谱产生的母离子有两种情况，将TCS衍生物的母离子和子离子对调整为m/z362/347和m/z360/345，分别建立MRM 模式扫描方法进行比对，MRM 扫描程序见表1。

表1 MRM 模式扫描程序Tab.1 Scanning program with MRM mode

采用以上2 种MRM 模式扫描程序分别对25μg·L－1的TCS衍生物和MTCS的混合溶液进行扫描，得到总离子流色谱图见图5。

结果表明:TCS衍生物和MTCS的总离子流色谱图完全一致，分辨率也基本相当，峰形尖锐对称且分离度良好，专属性强，无任何干扰。

图5 TCS衍生物和MTCS的混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.5 TIC chromatogram of mixed standard solution of derivate of TCS and MTCS

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器在MRM 模式1和MRM 模式2条件下对0.4，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μg·L－1的 混 合 标准溶液系列进行测定，以TCS 衍生物对应的TCS和MTCS的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。TCS和MTCS的质量浓度在0.4～20.0μg·L－1内与其对应的峰面积之间呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表2。

以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果见表2。

由表2可知:TCS和MTCS在MRM 模式扫描程序1时的线性相关系数较MRM 模式扫描程序2大，说明TCS 和MTCS 在MRM 模式扫描程序1时的线性关系更好，且TCS 在MRM 模式扫描程序1时的检出限和测定下限也低于MRM 模式扫描程序2，试验选择MRM 模式扫描程序1对TCS和MTCS进行分析。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度和回收试验

对空白西红柿、黄瓜、橙子和苹果样品添加0.02，0.10，1.00μg·kg－1的混合标准溶液，每个加标样品平行测定6次，计算TCS和MTCS的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

空白西红柿样品和对其添加0.20μg·kg－1混合标准溶液的西红柿样品的色谱图见图6。

图6 空白西红柿样品和添加0.20μg·kg－1混合标准溶液的西红柿样品的色谱图Fig.6 Chromatograms of blank tomato sample and tomato sample added with 0.20μg·kg－1 of mixed standard solution

2.5 样品分析

按照试验方法对从市场上随机采购的蔬菜(西红柿、黄瓜、芹菜和土豆)和水果(橘子、苹果、草莓和猕猴桃)等32个样品进行测定。结果表明:西红柿样品中检出了TCS和MTCS，其中TCS的质量分数 为0.219 ng·g－1，MTCS 的 质 量 分 数 为0.092 ng·g－1;TCS和MTCS的检出率均为3.1%。该样品的色谱图见图7。

图7 实际西红柿样品的色谱图Fig.7 Chromatogram of substantial tomato sample

本工作采用GC-MS/MS 对蔬菜和水果中的TCS和MTCS进行定性和定量分析，并应用于实际蔬菜和水果样品的测定。本方法简单易操作，检出限和测定下限低，专属性强，可灵敏、稳定地测定蔬菜和水果样品中痕量水平的TCS和MTCS，可为甄别农业初级产品中的新兴污染物TCS及其甲基代谢产物提供有效的技术支撑。