QuEChERS提取-超高效液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中氨基甲酸酯类农药的残留量

杭学宇，吴珺玮，宋 鑫，王 芹，冯晓青，王 露，徐 瑞，王丹丹，陆 娟

(1.淮安市疾病预防控制中心，淮安223001; 2.南通市疾病预防控制中心，南通226007)

农药对于提高农产品产量、预防病虫害具有重要的作用，常用的农药包括有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类等4大类。其中，氨基甲酸酯类农药具有杀灭鳞翅目和鞘翅目害虫的作用，同时具有作用快、适用范围广、稳定性低且易水解等特性[1]，在蔬菜种植中得到了广泛应用。生产过程中，由于缺乏对蔬菜种植过程中农药使用的监管，菜农为提高蔬菜产量盲目大量使用氨基甲酸酯类农药，导致农药残留量超标。氨基甲酸酯类化合物安全性的研究表明，氨基甲酸酯作为胆碱酯酶抑制剂，具有细胞毒性和遗传毒性[2]，已有氨基甲酸酯化合物引起慢性中毒的报道[3]。建立高效的测定氨基甲酸酯类农药残留量的分析方法，对确保蔬菜农药残留量符合国家相关标准的要求，以及提高蔬菜产品质量、保障环境安全和人类生命健康具有十分重要的意义。

测定蔬菜中农药残留量的传统前处理方法主要有基质固相分散法(MSPD)[4]、液-液萃取法(LLE)[5]、凝胶渗透色谱法(GPC)[6-7]等，这些方法均有制备步骤繁琐，消耗时间长，易造成目标分析物损失等缺点。QuECh ERS提取具有操作简单、提取效率高和试验成本低等优点[8]，已广泛应用于农药残留、真菌毒素和三环唑等化合物的测定过程中[9-10]，但仍存在净化效果差和回收率较低等问题[11]。

本工作采用Qu ECh ERS对蔬菜中的氨基甲酸酯类农药进行提取，结合单因素试验和响应面设计对所用固定相的组成进行优化。在最优条件下结合超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)对市场常见的扁豆、茼蒿和韭菜等蔬菜中6种氨基甲酸酯类农药残留量进行测定，可为氨基甲酸酯类农药的测定提供参考依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290 型超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪;FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器;TGL-16 型台式高速冷冻离心机;Vortex Geniez型涡旋振荡器;AR 2130型电子天平;TECHNE 型氮吹仪;HZQ/THZ型振荡器;MUL 9000(B)-H-20型纯水机。

6 种氨基甲酸酯化合物的单标准储备溶液:1 000 mg·L－1，介质为甲醇。

N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)和十八烷基键合硅胶(C18)吸附剂;乙腈为色谱纯;甲酸为优级纯;无水硫酸钠和氯化钠均为分析纯;试验用水为高纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱(75 mm×2.1 mm，2.7μm);进样量为5μL;柱温为35 ℃;流量为0.3 m L·min－1;流动相A 为含0.1%(体积分数，下同)乙酸的20 mmol·L－1乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program

2)质谱条件 电喷雾离子源，正离子扫描模式;多反应监测(MRM)模式;离子喷射电压为4 000 V;辅助干燥气压力为241.33 kPa，雾化气压力为275.80 k Pa，气帘气压力为206.85 k Pa;入口电压为10 V;离子源温度为600 ℃;驻留时间为100 ms。

其他质谱参数见表2，其中“∗”为定量离子。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

1.3 试验方法

取淮安各县、区的扁豆、茼蒿和韭菜等蔬菜样品适量，捣碎充分混匀后放入高速电动匀浆器中粉碎，于－20 ℃条件下保存待用。

称取10.00 g样品，加入含1.3%(体积分数，下同)甲酸溶液的乙腈10 m L，涡旋混匀后，超声提取20 min。加入8.2 g无水硫酸钠和3.0 g氯化钠，涡旋后，以5 000 r·min－1的转速离心5 min，取上清液于鸡心瓶中，用10 m L 的含1.3%甲酸溶液的乙腈重复提取一次，合并有机相，移取2.0 m L 有机相加入优化的QuEChERS 净化管中(内含有PSA 0.4 g、C180.25 g和GCB 8.2 mg)，涡旋振荡2 min，以5 000 r·min－1的转速离心2 min，取上清液经过0.22μm 有机滤膜过滤，得到待测溶液，按照仪器工作条件对其进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

按照仪器工作条件对10μg·kg－1的6种氨基甲酸酯类化合物的混合标准溶液进行测定，色谱图见图1。

2.2 QuECh ERS前处理条件的选择

Qu ECh ERS前处理过程是液-液萃取和基质分散固相萃取的结合，试验对液-液萃取过程中的提取溶剂和盐析剂进行了考察，同时对基质分散固相萃取过程中的吸附剂种类和用量进行了考察。

图1 6种氨基甲酸酯类化合物混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of the 6 carbamate compounds

试验选择乙腈为提取溶剂，但是氨基甲酸酯农药极性较大，且在碱性条件下易分解，试验采用正离子扫描模式，加入适量的甲酸有利于氨基甲酸酯类化合物的离子化，从而提高灵敏度，但加入过量的甲酸会抑制氨基甲酸酯类化合物的质子化，降低灵敏度[12]。试验考察了在乙腈中分别加入0.1%甲酸溶液、0.5%甲酸溶液、1%甲酸溶液和2%甲酸溶液时对6种氨基甲酸酯类化合物回收率的影响，结果见图2。

图2 不同的提取溶剂对6种氨基甲酸酯类化合物回收率的影响Fig.2 Effect of different extraction solvents on recovery of the 6 carbamate compounds

由图2 可知:随着甲酸溶液体积分数的增大，6种氨基甲酸酯类化合物的回收率逐渐增大;当甲酸溶液的体积分数为1%时，6种氨基甲酸酯类化合物的回收率达到较大值;继续增大甲酸溶液的体积分数，6种氨基甲酸酯类化合物的回收率趋于稳定。试验选择的提取溶剂为1%甲酸-乙腈溶液。

Qu ECh ERS方法中常用的盐析剂为氯化钠，试验考察了氯化钠的用量分别为0.5，2.0，3.5，5.0 g时对6种氨基甲酸酯类化合物回收率的影响，结果见图3。

结果表明:随着氯化钠用量的增大，6种氨基甲酸酯类化合物的回收率逐渐增大;当氯化钠用量为2.0 g时，6种氨基甲酸酯类化合物的回收率较好;继续增加氯化钠用量，6种氨基甲酸酯类化合物的回收率趋于稳定。试验选择的盐析剂为2.0 g的氯化钠。

图3 氯化钠用量对6种氨基甲酸酯类化合物回收率的影响Fig.3 Effect of amount of the sodium chloride on recovery of 6 carbamate compounds

应用QuECh ERS对氨基甲酸酯类农药进行前处理过程中，经常使用的吸附剂为PSA 和C18。PSA 吸附剂对脂肪酸结构化合物具有较强的吸附作用，C18吸附剂可以去除非极性化合物，但是PSA吸附剂和C18吸附剂去除色素能力的较弱。由于蔬菜中含有大量的色素，试验选择加入GCB吸附剂去除蔬菜提取液中的色素，降低基质噪声，提高检测灵敏度。以扁豆为研究对象，在样品溶液中加入0.4 g PSA 吸附剂和0.25 g C18吸附剂，添加质量分数为50μg·kg－1的混合标准溶液，以1%甲酸-乙腈溶液为提取溶剂，加入2.0 g氯化钠，试验考察了GCB的用量分别为5，10，30，40，50 mg时对6种氨基甲酸酯类化合物回收率的影响，结果见图4。

图4 GCB吸附剂的用量对6种氨基甲酸酯类化合物回收率的影响Fig.4 Effect of amount of GCB adsorbent on recovery of the 6 carbamate compounds

由图4可知:GCB吸附剂的用量增加至30 mg时，6种氨基甲酸酯的回收率均达到较大值;继续增加GCB 吸附剂的用量，克百威、3-羟基克百威的回收率反而下降。这可能是因为GCB 吸附剂对具有平面结构的化合物有亲和性，在去除叶绿素、甾醇、儿茶素和维生素等杂质的同时，对具有芳香环平面结构的克百威、3-羟基克百威也有较强的吸附作用。

2.3 Box-Behnken设计试验

本工作在单因素试验的基础上，使用Design-Expert 8.0.6 试 验 设 计 软 件，通 过Box-Behnken设计试验，将甲酸溶液的体积分数、氯化钠用量、GCB用量作为变量因素，分别记为A、B 和C，氨基甲酸酯的回收率作为应变量，记为y，Box-Behnken设计的显著性因素水平见表3。

对试验结果进行多重回归分析，数据与二阶多项式方程相拟合，拟合方程为y＝－3.33A2－2.63B2－1.98C2－0.20AC＋1.40A ＋0.55B－3.35C＋83.36。

表3 显著性因素水平Tab.3 Significance factor level

采用方差分析(ANOVA)对该模型进行统计学显著性分析，该二次多元回归模型具有显著性意义(p＜0.01)，失拟项为不显著，确定系数为0.986 0，表明试验结果与模型预期匹配度为98.6%，校正确定系数为0.968 0，表明该模型可解释96.8%的变化效应，本模型可应用于实际分析。

响应面图可直观地反应作为各因素交互项作用下的氨基甲酸酯类化合物的提取效果，结果见图5。

图5 氨基甲酸酯类纯化试验响应面图Fig.5 Response surface diagram of carbamate purification test

由图5可知:甲酸溶液的体积分数由0.1%增大至1.0%时，氨基甲酸酯类化合物的回收率呈增大趋势，这可能是由于氨基甲酸酯类在碱性条件下易分解，降低p H 有利于对其进行提取;随着甲酸溶液的体积分数进一步增大，氨基甲酸酯类化合物的回收率没有显著性变化。氯化钠质量在2.8 g 左右时，氨基甲酸酯类提取率最高，这可能是因为氯化钠增强溶液的离子效应，促进分层提高氨基甲酸酯类化合物的提取效率。GCB的添加量对涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威和涕灭威的提取效果无明显影响，而GCB用量达到32 mg后，其他几种氨基甲酸酯类农药的回收率均显著性降低。根据构建的模型计算得到最佳提取净化条件为:含1.3%甲酸溶液的乙腈、3.0 g氯化钠和8.2 mg GCB，预计回收率为85.0%。在最优条件下进一步进行试验验证，6 种氨基甲酸酯农药的回收率为80%～105%，平均回收率为84.7%。优化的Qu ECh ERS法不仅可以去除杂质减少基质干扰，还能够满足农残检测回收率的要求。

2.4 工作曲线、检出限和测定下限

分别向8份阴性扁豆样品提取液中加入6种氨基甲酸酯类化合物混合标准溶液适量，配制0.200～100μg·L－1的工作溶液系列，按照仪器工作条件对其测定，以6种氨基甲酸酯类化合物的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果表明，6种氨基甲酸酯类化合物的质量浓度均在0.200～100μg·L－1内与其对应的峰面积之间呈线性关系，线性回归方程和相关系数见表4。以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出 限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果见表4。

表4 线性参数、检出限和测定下限Tab.4 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收试验

分别向阴性扁豆样品基质溶液中添加1，50，100μg·L－1的6种氨基甲酸酯类混合标准溶液，按照试验方法进行测定，每个浓度水平的加标样品平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，结果见表5。

表5 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

结果表明:6种氨基甲酸酯类化合物的回收率为81.0%～111%，RSD 为2.8%～4.9%，说明该方法具有良好的精密度。

2.6 样品分析

按照试验方法对茼蒿、韭菜和扁豆等10份样品进行测定。结果表明:在6个样品中均检出了氨基甲酸酯类化合物;1号茼蒿样品中检出涕灭威砜和克百威的质量分数分别为1.77，1.86μg·kg－1;3号茼蒿样品中检出3-羟基克百威的质量分数为2.08μg·kg－1;4号韭菜样品中检出涕灭威亚砜的质量分数为1.53μg·kg－1;7号扁豆样品中检出克百威的质量分数为1.93μg·kg－1;8号扁豆样品中检出涕灭威的质量分数为1.27μg·kg－1;9号扁豆样品中检出克百威的质量分数为1.19μg·kg－1。本工作建立了Qu ECh ERS对蔬菜样品进行前处理，结合UPLC-MS/MS测定其中6种氨基甲酸酯类农药的分析方法。方法操作过程简单、快速，灵敏度高，能满足国内外氨基甲酸酯类农药残留分析测定的要求。