应用顶空-气相离子迁移谱分析百合发酵乳的风味物质

袁志鹰，黄惠勇，谢梦洲，周小江，李 亮，黄 培

(1.湖南中医药大学，长沙410208; 2.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，长沙410208;3.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，长沙410208)

中药百合属于多年生草本植物[1-2]，为我国常用的药、食两用大宗中药材，常以鳞茎和珠芽作为药、食两用部位，始载于汉朝《神农本草经》，具有润肺止咳和养心安神的功效[3]。湖南省龙山县独特的环境条件造就了龙山百合品质优良且产量高。长期以来，龙山百合的研究主要集中在植物资源、药材质量控制和药效成分等方面[4-8]，鲜有人对百合药膳食品的开发进行研究。

发酵乳是利用牛奶在乳酸菌作用下发酵制成的产品[9]，可以通过添加果蔬、药食同源中药等赋予其特殊的风味、口感和营养价值[10-11]。百合发酵乳是利用鲜百合和牛奶在乳酸菌作用下发酵制成的产品，因百合具有特殊的清香，百合酸奶风味独特[12]。另外，中药百合养心安神的功效赋予了百合发酵乳独特的保健价值。风味是发酵乳品质的重要特征，挥发性风味物质的研究有助于定义保健发酵乳的品质，并可以评估发酵乳在发酵过程中的变化，加强发酵乳质量控制。由于发酵乳基质的复杂性，采用常见的分析方法研究发酵乳食品中的风味物质在提取、分离和定量方面具有一定的难度[13-14]。近年来，气相离子迁移谱(GC-IMS)在分析食品中的风味物质研究中取得了突破，该技术具有无损绿色，快速简便的优势[15-17]。

本工作建立了顶空-GC-IMS(HS-GC-IMS)测定龙山百合原料及其保健发酵乳中风味物质的含量，并通过指纹图谱结合正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)方法分析不同样本间的特征标志物和差异性，以期对龙山特色百合资源产品的深度开发提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Flavour Spec®型气相离子迁移谱仪;DL-4005型全自动发酵机;Philips SCF870120型全自动食品蒸制搅拌仪;Millipore型纯水仪;AR124CN 型电子天平。

百合样品采自湖南省龙山县，经湖南中医药大学药学院周小江教授鉴定为卷丹百合的新鲜肉质鳞茎;牛奶为某品牌纯牛奶;双歧杆菌酸奶发酵剂购自于某公司。

1.2 仪器工作条件

1)顶空条件 顶空进样体积为500μL;孵育时间为10 min;孵育温度为45 ℃;进样针温度为50 ℃。

2)GC-IMS 条 件 FS-SE-54-CB-1 色 谱 柱(15 m×0.53 mm，1μm);柱温为40 ℃，IMS温度为45 ℃;漂移气(E1)和载气(E2)均为氮气，纯度为99.999%。色谱洗脱程序:0～15 min时，E1的流量为150 m L·min－1;0～2 min 时，E2的流量为2 m L·min－1;2～10 min时，E2的流量由2 m L·min－1增大至100 m L·min－1;10～15 min 时，E2的流量由100 m L·min－1增大至150 m L·min－1。

1.3 试验方法

1.3.1 百合原料制备工艺

将采集的百合新鲜鳞茎洗净，将其剥成单瓣，将百合鳞茎放入全自动食品蒸制搅拌仪中，加入适量的水，设置为蒸制6 min，打浆30 s，得到细腻的匀浆状蒸制百合(样品代码ZBH)，去其生腥味。

1.3.2 百合发酵酸奶制备工艺

取纯牛奶100 m L，杀菌(90 ℃，5 min)，冷却至室温，加入0.1 g的双歧杆菌酸奶发酵剂接种，设置发酵时间12 h，即得原味酸奶(样品代码SN-1/2)。另取纯牛奶100 m L，按上述操作，发酵完成后，加入1.0 g匀浆状蒸制百合，均质，即得百合酸奶(样品代码SN-3/4)。同时另取纯牛奶100 m L 五份，如上操作，但设置发酵时间分别为8，10，12，14，16 h，即得不同发酵时间的百合发酵酸奶(样品代码BHSN)，每个样品平行制备2份，共16批次样品，具体样品信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of the samples

1.3.3 样品的前处理

分别取1.0 g蒸制百合、百合发酵酸奶、百合酸奶及原味酸奶样品置于20 m L顶空样品瓶中，45℃平衡孵育10 min，将注射器加热至80℃，将100μL样品顶空自动注入GC-IMS中，15 min后得到样品的挥发性组分信息。

1.3.4 数据处理

利用工作站Laboratory Analytical Viewer，Reporter，Gallery Plot，Simca PCA 以及GC-IMS Library Search查看分析谱图，自动检索各组分NIST数据库和IMS数据，对物质进行定性分析，并生成指纹图谱对比，对样品进行风味物质的OPLS-DA。

2 结果与讨论

2.1 GC-IMS检测结果

蒸制百合、百合发酵酸奶、百合酸奶、原味酸奶的挥发性风味物质的检测结果见图1。通过检索NIST 数据库和IMS 数据，蒸制百合、百合发酵酸奶、百合酸奶、原味酸奶的风味物质包括二聚体共鉴定出24种化合物以及其迁移时间，详见表2。

2.2 蒸制百合、百合酸奶和百合发酵酸奶风味物质的指纹图谱分析

由图1可以看出，蒸制百合中风味物质最少，百合发酵酸奶中风味物质最多，而百合酸奶与百合发酵酸奶挥发性物质非常相似。为对比不同样品间挥发性有机物的差异(百合发酵酸奶取发酵时间为12 h的发酵样品)，采用LAV 软件的Gallery Plot功能，选取离子迁移图中所有的待分析区域，生成指纹图谱。结果表明:正己醇等物质在蒸制百合样品中的含量较多，在其他样品中含量非常少，可以将其视为蒸制百合的特征挥发性有机物;乙酸乙酯二聚体、3-甲基-1-丁醇和2-甲基丁酸甲酯等挥发性有机物在百合酸奶、百合发酵酸奶以及蒸制百合中含量较高，且在原味酸奶中含量最低，故可推测百合酸奶及百合发酵酸奶中该类物质主要来源于蒸制百合样品;丁二酮、正丙醇等挥发性物质在蒸制百合和原味酸奶中含量均较高，但在百合酸奶及百合发酵酸奶中含量均降低;2-戊酮、2-庚酮、正丁醇及其二聚体、2-戊酮及其二聚体等物质在原味酸奶中含量最高，且在蒸制百合中含量很低，可见百合酸奶及百合发酵酸奶中此部分挥发性有机物主要来源于原味酸奶;正己醛二聚体、丙酸乙酯及其二聚体、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇和2-己酮等物质在蒸制百合及原味酸奶中含量很少，而百合酸奶和百合发酵酸奶中则含量较高，这类物质可以作为百合酸奶、百合发酵酸奶区别于原味酸奶和蒸制百合的标志物。从整体上分析，百合酸奶与百合发酵酸奶的挥发性有机物非常相似。将鉴定得到的24种化合物的信号峰的峰强度进行进一步分析可得到这2种样品中挥发性物质含量差异，结果见图2。

图1 样品的气相离子迁移谱图Fig.1 GC-IMS spectra of the samples

表2 24种风味物质的鉴定信息Tab.2 Indentification information of 24 flavoring substances

图2 样品信号峰强度差异图Fig.2 Differences of peak intensities of the samples

2.3 不同发酵时间的百合发酵酸奶风味物质分析

为对比不同发酵时间的百合发酵酸奶风味物质的差异，采用LAV 软件的Gallery Plot功能，选取离子迁移图中所有的待分析区域，生成指纹图谱。将不同发酵时间样品鉴定得到的24种化合物的信号峰的峰强度进行差异分析可得图3。

结果表明:不同的风味物质含量具有明显差异;乙酸乙酯二聚体、2，3-戊二酮二聚体、正丙醇等3种成分的含量在不同发酵时间的百合发酵酸奶中都较高，而正丁醇二聚体含量在发酵8 h时最高，且随着发酵时间的延长而减少;正丙醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基丁酸甲酯等挥发性风味物质在不同发酵时间的样本中的含量变化比较稳定。

图3 不同发酵时间样本信号峰强度差异图Fig.3 Differences of peak intensities of samples with different time of fermentation

2.4 样品的正交偏最小二乘法判别分析

对样品风味物质进行OPLS-DA，结果见图4。

百合酸奶与百合发酵酸奶的样品间呈聚集状，而蒸制百合、原味酸奶样品间呈离散状态，样品内部点均呈聚集状。OPLS-DA 图可以准确区分蒸制百合、原味酸奶、百合酸奶、百合发酵酸奶。4组样品间，百合酸奶和百合发酵酸奶相似度最大，而原味酸奶与百合酸奶、百合发酵酸奶的相似度远大于蒸百合，即百合酸奶、百合发酵酸奶中挥发性成分主要来源于原味酸奶。由图5的不同发酵时间的百合发酵酸奶的OPLS-DA 图分析可知，根据挥发性风味物质的类似性，5个不同发酵时间的样本，可分为8 h、10 h和12 h、14 h和16 h等3组。2个主要的风味挥发性有机物成分(乙酸乙酯二聚体、2，3-戊二酮二聚体)在12 h的发酵时间中含量均较高，2，3-戊二酮具有奶油、焦糖香气，并带有坚果底香，而低含量的乙酸乙酯具有清灵、微带果香的酒香。因此，通过指纹谱图及OPLS-DA 判断12 h的发酵时间相对于其他发酵时间更优。

图4 百合、百合酸奶、百合发酵酸奶风味物质OPLS-DA 分析Fig.4 OPLS-DA analysis of flavoring substances in lily，lily yoghurt and lily fermented yoghurt

图5 不同发酵时间的百合发酵酸奶风味物质OPLS-DA 分析Fig.5 OPLS-DA analysis of flavoring substances in lily fermented yoghurt with different fermentation time

风味是发酵乳食品生产者和消费者关注的热点，风味挥发物质是发酵乳品质的重要特征。本工作采用HS-GC-IMS技术共鉴定出24种挥发性物质。通过HS-GC-IMS指纹图谱差异性分析，得到了15种特征性标志物，如丙酸乙酯二聚体、2-己酮等，通过这些特征标志物可以作为判断百合酸奶和原味酸奶的差异标志物，并且发现正丁醇二聚体可以作为判断百合发酵乳不同发酵时间的指示剂。结合指纹图谱和OPLS-DA 分析，HS-GC-IMS技术可以很好的区分百合、百合发酵酸奶与原味酸奶，并可以对发酵时间与品质的关联性提供技术指导。因此，基于HS-GC-IMS的百合发酵乳的风味研究有助于定义百合保健发酵乳的品质，并可以评估发酵乳发酵过程中的风味物质动态变化，对加强百合发酵乳质量控制，深度开发湖南特色百合资源具有重要现实意义。