羟丙哌嗪手性拆分的HPCE新方法

张 思，沈静茹，陆金富，覃信铭

(中南民族大学 化学与材料科学学院 分析化学国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074)

羟丙哌嗪(Dropropizine)是一种通过作用于外周受体及其传入导体来抑制咳嗽反射的外周性镇咳药[1]。1988年由意大利 Dompe'Farm S.P.A公司研发上市[2]，它以外消旋形式或其纯对映体销售，两者在世界范围内都以各种药物剂型(例如片剂，糖浆和口服溶液)获得，由于优良的药效性得到广泛应用[3]。纯左旋对映体的镇咳效果与外消旋羟丙哌嗪相当，但中枢镇静反应明显降低，且无药物依赖性，羟丙哌嗪的药物副作用主要来源于其右消旋体[4]。因此，有必要开发简单、高效的方法分离测定手性药物羟丙哌嗪。

目前，主要有高效液相色谱法(HPLC)实现羟丙哌嗪单一对映体的分析测定。Balaji等[5]从大鼠血浆中提取出羟丙哌嗪异构体，在甲醇和二乙胺为流动相的Chiralpak IG-3色谱柱上直接分离左羟丙哌嗪和右羟丙哌嗪，分离度Rs达到 4.45。黄勇等[6]在Chiracel-OC手性柱正相模式下，拆分了羟丙哌嗪对映体酯化产物，但未能实现羟丙哌嗪的直接分离。与HPLC相比，高效毛细管电泳(HPCE)具有灵敏度高、分辨率高和成本低等特点，已成为对映体分离领域的有力手段。衍生化的β-环糊精(CD)是目前研究最广泛的手性HPCE拆分的选择剂之一，其中有些β-CD衍生物与手性分子相互作用较强，由于静电相互作用易于形成包合，显现出较好的对映体选择性。论文采用组氨酸-β-环糊精(β-CD-E2)衍生物制成HPCE手性整体柱并用于羟丙哌嗪消旋体的手性拆分，优化了拆分条件后构建了羟丙哌嗪对映体手性拆分的HPCE新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

负电源高效毛细管电泳仪(CL1020，北京彩陆科学仪器有限公司)，自动电位pH滴定计(ZD-2型，上海伟业仪器厂)，微孔滤膜(0.22 μm，津腾欧美国家进口膜)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，陶氏化学公司)，一水合柠檬酸、磷酸氢二钠(Na2HPO4)和柠檬酸三钠(国药集团化学试剂有限公司)，磷酸(H3PO4，天津科密欧化学试剂有限公司)，羟丙哌嗪标准品(98.5%，阿拉丁试剂)，β-CD-E2毛细管整体柱(实验室自制)。

1.2 电泳条件

用于测定目标化合物的波长为254 nm，在制备的毛细管整体柱(有效长度40 cm×φ75 μm)上进行样品分析。首次使用整体柱用HCl和水各冲洗30 min，每次在开始实验之前，毛细管整体柱用水冲洗10 min，用背景电解质(BGE)加电场处理30 min。羟丙哌嗪样品在手动压力下进样20 s，采用负电源模式，对样品进行分离分析。所有溶液均经0.22 μm滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 探究缓冲体系对羟丙哌嗪对映体分离的影响

电泳仪上设置电压-20 kV，背景缓冲液pH值4.00，浓度50 mmol/L，手动进样20 s，羟丙哌嗪浓度2.0×10-5mol/L的条件下，通过改变缓冲液种类，探究了Tris-H3PO4，柠檬酸三钠-柠檬酸，Tris-柠檬酸以及Na2HPO4-柠檬酸缓冲体系对β-CD-E2整体柱拆分羟丙哌嗪消旋体的洗脱能力。

结果表明，不同的缓冲体系与样品分子的相互作用力有差异，影响着电渗流的平衡，进而表现出不同的洗脱能力。在pH值4.00条件下，柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液对羟丙哌嗪的洗脱能力最弱，Tris-柠檬酸缓冲液对样品分子几乎不具有对映体选择性，Tris- H3PO4和Na2HPO4-柠檬酸缓冲液对羟丙哌嗪消旋体都具有一定的手性识别能力，且Na2HPO4-柠檬酸的洗脱能力更强。因此，选用Na2HPO4-柠檬酸作为羟丙哌嗪手性拆分的最佳缓冲体系。

2.2 探究缓冲液pH值对羟丙哌嗪对映体分离的影响

在制备的β-CD-E2整体柱上，选择Na2HPO4-柠檬酸作为流动相，浓度30 mmol/L，其他条件同2.1，通过改变缓冲液pH值，使其为3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00，分别考察了pH值对羟丙哌嗪消旋体拆分的影响，部分拆分结果如图1所示。

图1 缓冲液pH值对羟丙哌嗪对映体分离的影响
Fig.1 Effect of buffer pH on the enantioseparation of dropropizine

结果表明，缓冲液的pH不仅能够影响固定相和分析物的表观电荷，而且影响柱内电渗流(EOF)的平衡，进而影响样品分子的分离。pH值在3.50～6.00范围内，β-CD-E2整体柱分离羟丙哌嗪均能达到基线分离。pH值3.50～5.00时，背景缓冲液酸度减小，毛细管内壁EOF增大，样品分子的迁移时间随pH值增大而减小；但是pH值5.00～6.00时，毛细管内壁电荷密度随pH值而增大，影响复合物的解离状态，导致羟丙哌嗪对映体的分析时间又会逐渐增大；pH值6.00～7.00范围内，此时电解质接近中性，影响了β-CD-E2固定相对羟丙哌嗪的有效手性识别能力，不利于样品分子的洗脱。综合考虑羟丙哌嗪两对映体的分析时间和洗脱强度，选择5.00为羟丙哌嗪分离的最佳pH值。

2.3 探究羟丙哌嗪对映体分离的线性范围

在选择性优化条件下(检测波长254 nm，分离电压-20 kV，Na2HPO4-柠檬酸 pH值5.00，浓度30 mmol/L，手动进样20 s)，用羟丙哌嗪消旋体标准品配制了不同浓度的溶液，探究了β-CD-E2整体柱分离羟丙哌嗪对映体的线性范围。结果表明，在9.8×10-6～2.0×10-5mol/L范围内，羟丙哌嗪浓度与两对映体峰高、峰面积呈一定的线性相关。

3 结语

本研究利用β-CD-E2作为手性固定相制备的HPCE整体柱拆分了手性药物羟丙哌嗪，通过对缓冲体系、缓冲液pH值等分离条件的选择优化，实现了羟丙哌嗪8 min内的快速分离。在检测波长254 nm，30 mmol/L pH值5.00的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，样品浓度2.0×10-5mol/L，电压-20 kV，手动进样20 s的最佳分离条件下，羟丙哌嗪对映体的分离度Rs达到40.52，分离结果优于已有文献[5-6]报道结果。这说明，经过衍生后的β-CD分子内部既存在疏水空腔，同时又带有羧基、氨基基团。羟丙哌嗪结构中的羟基易与β-CD-E2中氨基、羧基产生较强的静电相互作用、氢键作用以及偶极偶极相互作用从而表现出良好的对映体选择性。本研究为手性药物羟丙哌嗪建立了一种新的HPCE分离分析体系。

感谢中央高校基本科研业务费专项资金项目(CZY19037)的资助。