葱白提取物对心肌梗死模型大鼠心肌纤维化及TGF-β1与Smad2蛋白表达的影响*

赵辉，邢若丹，谢婷婷，马威，杨文强，余志华，田立群，吴勇宏，柯于鹤

(1.武汉市中西医结合医院老年病科，武汉 430022；2.湖北中医药大学第一临床学院，武汉 430065；3.武汉市中西医结合医院心血管内科，武汉 430022)

心肌纤维化是指心肌胶原纤维过量沉积和比例失调最终导致心功能不全的一种病理变化，其在心力衰竭的发生、发展过程中有重要作用，抑制心肌纤维化是治疗心力衰竭的一个重要靶点[1]。心肌纤维化是心脏慢性炎症病变的过程，是多种致病因子长期作用的结果。其中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α被认为是心肌纤维化过程中的胞外刺激因素，而血清脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)浓度反映心功能的情况，可用于诊断心力衰竭，评估疗效和预后[2]。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β1是重要的促心肌纤维化调控因子，Smads蛋白通过介导TGF-β1细胞内信号传导促进心肌梗死后纤维化的发生，TGF-β/Smads 信号通路与心肌纤维化密切相关[3]。葱白味辛，性温，具有发汗解表、散寒通阳的作用，现代药理研究提示葱白提取物具有抑制炎症反应、抗氧化、调脂、扩张冠脉等作用[4]。本实验通过观察葱白提取物对心肌梗死后心力衰竭大鼠炎症指标、TGF-β1及Smad2蛋白表达的影响，探讨葱白提取物抑制心肌纤维化，逆转心室重构的作用，为其临床应用于心力衰竭治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠65只，体质量(260±10)g，购自湖北省疾病预防控制中心，动物合格证号：42000600026538，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂)2017-0065，实验动物设施使用证号：00266125。大鼠饲养于室温(20～24 ℃)、相对湿度45%～55%环境，12 h/12 h明暗交替，给予充足灭菌饮食，适应性喂养7 d。

1.2药物与试剂 葱白提取物(武汉中西医结合医院药物制剂中心制备，批号：2015023116)，聚山梨酯-80(北京迈瑞达科技公司，M1667)配成浓度0.07%混悬液；培哚普利(8 mg/片，天津制药厂生产，批准文号：H20103382)，纯化水配成浓度0.07%的混悬液。大鼠IL-6、TNF-α、BNP试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，货号：E-EL-R1025C、E-EL-R0019C、E-EL-R0016C)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量检测试剂盒(武汉谷歌生物科技有限公司，货号：G2026)、一抗(艾博抗上海贸易有限公司，货号：TGF-β1ab27969、Smad2 ab40855)、二抗(艾博抗上海贸易有限公司，货号：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔GB23303 )、dNTP(北京天根生化科技有限公司，货号：LOT#P4325)、HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：R101-01/02)、Taq Plus DNA Polymerase(北京天根生化科技有限公司，货号：ET105-01)。

1.3主要仪器 DHG 9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)，JY300 水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)，C2500-R-230V微型高速离心机(美国)，奥林巴斯BX53型生物显微镜，Alpha InnotechalphaEaseFC型灰度分析仪，ABI QuantStudio 6型实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪等。

1.4模型制备 参照文献[5]制备大鼠心力衰竭模型，大鼠适应性喂养7 d，术前 12 h禁食、6 h禁水，9.9%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，背位固定，颈部及胸部备皮、消毒，连接心电图，经喉气管插管连接小动物呼吸机。于大鼠左胸第3～4肋间开胸，暴露心脏，撕裂心包膜后，在左心耳下2 mm处以6号线穿过结扎，以心电图I、II 导联 ST段抬高及左心室搏动减弱，左心室前壁颜色变浅、变白为结扎成功标志，手术后放回心脏，缝合胸腔，回笼饲养1周。假手术组只穿针，不结扎。造模过程中，大鼠共存活54只，死亡11只，死亡率16.9%，其中假手术组无死亡。

1.5模型分组及给药 按大鼠体质量采用随机数字表法将大鼠分为假手术组，模型对照组，葱白提取物小、中、大剂量组(简称葱白小、中、大剂量组)，培哚普利组，每组9只，按照《人和动物及各类动物间药物剂量的换算方法》[6]，以成人每日常用剂量进行大鼠与人的用药量换算，葱白小、中、大剂量组分别给予1，2，4 mg·kg-1葱白提取物灌胃，培哚普利组给予2 mg·kg-1培哚普利混悬液灌胃，模型对照组和假手术组给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，每日1次，连续药液灌胃12周。

1.6标本采集和检测指标 给药12周后，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清中BNP、IL-6、TNF-α含量。取心肌组织石蜡包埋切片，经苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色，中性树胶封片后，显微镜下观察并拍照分析。Masson染色切片通过Image J图像分析软件计算心肌组织胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF )，即选定区域蓝色组织(胶原纤维)占总染色组织面积的百分比，每张切片随机取5个(×100倍)视野测量，取其平均值。

1.7Western blotting法检测心肌TGF-β1、Smad2蛋白表达 取适量大鼠心肌组织，BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度，计算相应蛋白上样量并加入相应缓冲盐，加热变性10 min行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)分离，取出电泳凝胶转膜，转好的膜于室温下脱色摇床上用5%脱脂牛奶(0.5%三羟甲基氨基甲烷缓冲盐含聚山梨酯-20缓冲液配制)，封闭1 h。然后根据一抗试剂说明书加入稀释一抗(1：2000)，4 ℃孵育过夜，孵育膜需三羟甲基氨基甲烷缓冲盐含聚山梨酯-20缓冲液洗5 min×3次；再加入稀释二抗(1：3000)，室温下孵育30 min后，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐含聚山梨酯-20缓冲液洗5 min×3次，最后用电化学发光试剂盒检测显色条带强弱，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。

1.8实时荧光定量PCR法检测心肌TGF-β1、smad2 mRNA的表达 Trizol法提取总RNA，用微量分光光度计测定溶解后的RNA的吸光度(A)值，以此计算RNA的浓度和纯度。反转录按试剂盒说明书操作，取总RNA4.96 μg，在反转录酶Hiscript Reverse Transcriptase和引物 olig(dT)18条件下进行反转录，得到cDNA链，并据此将每个样本的cDNA浓度稀释10倍。PCR反应体系为：cDNA4 μL、上下游引物各0.4 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL、50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL、H2O 4.8 μL。所用引物由擎科生物公司合成。TGF-β1上游引物：5′-GTGGCTGAACCAAGGAGACGGAATA-3′，下游引物：5′- ACCTCGACGTTTGGGACTGATC-3′，产物长度118 bp；smad2上游引物：5′- GGCTGAACTGTCTCC-TACCACTCTC-3′，下游引物：5′- ACCTATGTAATAC-AAGCGCACTCCC-3′，产物长度289 bp；GAPDH上游引物：5′- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，产物长度253 bp。以GAPDH 作为内参照，循环参数：预变性50 ℃×2 min，变性95 ℃×10 min，退火95 ℃×30 s，延伸60 ℃×30 s，共40个循环。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。

2 结果

2.1各组大鼠BNP、TNF-α、IL-6水平比较 模型对照组BNP、TNF-α、IL-6较假手术组均显著增高(P<0.01)；培哚普利组和葱白小、中、大剂量组BNP、TNF-α、IL-6含量均较模型对照组显著降低(P<0.01)。与葱白大剂量组比较，葱白小剂量组BNP含量显著增高(P<0.01)；葱白小剂量组、葱白中剂量组TNF-α含量显著增高(P<0.01)；葱白小剂量组IL-6含量显著增高(P<0.01)。与培哚普利组比较，葱白小剂量组BNP含量显著增高(P<0.01)，葱白小剂量组、葱白中剂量组TNF-α含量显著增高(P<0.01)。 见表1。

表1 6组大鼠BNP、TNF-α、IL-6含量比较

Tab.1ComparisonofthecontentofBNP，TNF-αandIL-6amongsixgroupsofrats

组别BNPTNF-αIL-6假手术组246.5±33.8101.0±16.1155.0±15.2模型对照组539.7±53.4①408.5±57.0①355.5±39.5①培哚普利组310.4±39.3248.0±35.4246.6±38.3葱白 小剂量组361.8±42.2②318.5±46.5②276.6±32.7② 中剂量组325.6±43.0③308.6±35.2②252.4±37.6 大剂量组280.4±35.4235.6±42.5222.5±39.3F35.88730.79317.409P0.0000.0000.000

①与假手术组比较，t=7.561，24.780，22.010，P<0.01；②与葱白大剂量组比较，t=6.444，6.448，4.189，6.753，P<0.01；③与葱白大剂量组比较，t=3.647，P<0.05。

①Compared with the sham operation group，t=7.561，24.780，22.010，P<0.01；②Compared with the high-dose Allium Stalk group，t=6.444，6.448，4.189，6.753，P<0.01；③ Compared with the high-dose Allium Stalk group，t=3.647，P<0.05.

2.2各组大鼠心脏组织HE染色及Masson染色结果 HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞结构完整、排列整齐，少量坏死心肌细胞，炎症细胞局部浸润；模型对照组大鼠心肌细胞水肿、坏死明显，结构破坏、排列凌乱，坏死区域可见结缔组织增生，大量炎症细胞浸润。药物干预后，与模型对照组相比，各治疗组大鼠心肌细胞水肿、坏死数量均减少，局部可见完整心肌细胞，结缔组织增生较轻，炎症细胞浸润面积缩小，其中葱白大剂量组和培哚普利组心肌细胞水肿、坏死数量减少较葱白小、中剂量组显著，保留完整心肌细胞数量较多(图1)。

Masson染色结果显示，假手术组大鼠心肌组织排列整齐，染色均匀，基本无胶原纤维；心肌梗死导致模型对照组大鼠心肌组织破坏严重，心肌细胞残存较少，胶原纤维增加明显，出现显著心室重塑表现。药物干预后，各治疗组大鼠较模型对照组完整心肌细胞增多，局部可见新生血管排布，胶原纤维不同程度减少，其中葱白大剂量组与培哚普利组仅见少量胶原纤维增生，心肌细胞大多完整，心肌纤维化程度较轻(图2)。通过Image J图像分析软件计算各组大鼠心肌CVF，结果假手术组，模型对照组，葱白小、中、大剂量组和培哚普利组CVF分别为(0.95±0.19)%，(21.02±1.27)%，(14.14±3.43)%，(9.56±0.86)%，(5.71±1.10)%和(5.03±0.92)%。模型对照组较其他组CVF值明显升高，葱白提取物各治疗组间CVF值随葱白治疗剂量增加而减少。

2.3各组大鼠心肌TGF-β1、Smad2蛋白表达 与假手术组大鼠相比，模型对照组大鼠心肌细胞内TGF-β1、Smad2表达明显增加(t=28.992，44.930，P<0.01)；与模型对照组比较，葱白大剂量组、葱白中剂量组及培哚普利组TGF-β1、Smad2蛋白表达均下调(t=21.310，27.870，P<0.01)，葱白提取物抑制作用呈浓度依赖性(P<0.05)；葱白小剂量组TGF-β1、Smad2表达趋势有所下调，但与模型对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

2.4RT-CPR结果 与假手术组相比，模型对照组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2表达显著增加(P<0.01)；药物干预后，与模型对照组相比，葱白大、中、小剂量组和培哚普利组均可抑制心肌梗死大鼠心肌中TGF-β1、Smad2的表达(P<0.05)，其中葱白大剂量组和培哚普利组抑制作用显著，两组之间差异无统计学意义(P>0.05)，葱白提取物的抑制作用呈浓度依赖性(图4)。

A.假手术组；B.模型对照组；C.葱白小剂量组；D.葱白中剂量组；E.葱白大剂量组；F.培哚普利组。

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.

Fig.1HEstainingresultsofsixgroupsofrathearttissue(×400)

A.假手术组；B.模型对照组；C.葱白小剂量组；D.葱白中剂量组；E.葱白大剂量组；F.培哚普利组。蓝色区域为纤维化区域。

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.The blue area indicates fibrosis.

Fig.2Massonstainingontheheartsofsixgroupsofrats(×100)

A.假手术组；B.模型对照组；C.葱白小剂量组；D.葱白中剂量组；E.葱白大剂量组；F.培哚普利组；①与假手术组比较，t=21.310，27.870，P<0.01；②与模型对照组比较，t=28.990，44.930，P<0.01。

图3 6组大鼠心脏组织中TGF-β1、Smad2蛋白表达(n=3)

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.①Compared with sham operation group，t=21.310，27.870，P<0.01；② Compared with the model control group，t=28.990，44.930，P<0.01.

Fig.3TheproteinexpressionofTGF-β1andSmad2proteinsintheheartsofsixgroupsofrats(n=3)

3 讨论

心肌纤维化是心肌梗死后心功能下降的主要原因，表现为心肌细胞大量坏死，胶原纤维在间质中过量聚集，细胞外基质各型比例失调，心肌组织排列紊乱，导致心室重构，心脏收缩能力下降和顺应性降低，从而导致心功能失调甚至心力衰竭。心肌纤维化的形成机制非常复杂，心肌梗死后往往伴随一系列的炎症反应，这些炎症反应在纤维化的发生、发展过程中起着重要的作用[7]。胡爽等[8]提出，多种炎症细胞因子，如IL家族、TNF-α等可通过局部损伤、炎症反应形式，诱导心肌纤维细胞增生，导致心肌纤维化，抑制炎症反应可减轻心肌纤维化。本实验研究表明，葱白提取物可降低TNF-α和IL-6在心肌梗死后大鼠血液中的含量，从而减少氧化应激和调节炎症递质，改善心脏功能和抑制心肌纤维化，HE染色和Masson染色结果可见药物干预后，心肌梗死后大鼠心肌组织中炎症细胞浸润减少，心肌纤维化程度降低。

A.假手术组；B.模型对照组；C.葱白小剂量组；D.葱白中剂量组；E.葱白大剂量组；F.培哚普利组。①与假手术组比较，t=15.900，36.340，P<0.01；②与模型对照组比较，t=4.852，21.840，P<0.05；③与葱白小剂量组比较，t=5.334，11.600，P<0.05；④与葱白中剂量组比较，t=9.954，6.230，P<0.05。

图4 6组大鼠心肌TGF-β1、Smad2 mRNA表达(n=3)

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.①Compared with the sham operation group，t=15.900，36.340，P<0.01；②Compared with the model control group，t=4.852，21.840，P<0.05；③Compared with the low-dose Allium Stalk group，t=5.334，11.600，P<0.05；④Compared with the medium-dose Allium Stalk group，t=9.954，6.230，P<0.05.

Fig.4ThemRNAexpressionsofTGF-β1andSmad2inmyocardiuminsixgroupsofrats(n=3)

在众多信号传导通路中，TGF-β1/Smads通路是公认的介导器官纤维化的信号转导通路。TGF-β1发挥生物学效应，是通过Smad 蛋白介导细胞内的信号传递，诱导细胞内Smad2和Smad3表达上调，导致心肌细胞外基质产生和沉积，胶原纤维过量聚集促进心肌纤维化[9]。近年来的研究表明，单味中药或复方中药在抑制TGF-β1/Smads通路，抑制心肌纤维化方面有一定的作用[10]。向家培等[11]研究表明参松养心胶囊就可调低Smad3的表达，减少Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达量，从而抑制心肌纤维化。中医认为阳气虚衰则无力鼓动血脉，气血运行不畅则气滞血瘀；阳虚则寒，温煦、气化失司，则水饮内聚，上凌心脉，故心力衰竭可从温通经脉入手治疗[12]。葱白，辛温，具有发表、散血、通阳的功效，既往研究证明葱白提取物可抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达，延缓Ⅲ型胶原蛋白的降解，降低Ⅰ/Ⅲ型胶原蛋白的比例，抑制心肌纤维化[13]。本研究表明葱白提取物可降低心肌梗死大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2蛋白表达量，细胞外基质产生和沉积减少，心肌纤维化程度减轻，其作用机制可能与抑制TGF-β1/Smads通路的信号传导有关。实验表明各剂量组BNP明显降低，呈现剂量依赖效应，说明葱白提取物能改善大鼠心功能，这种作用可能与其抑制心肌纤维化有关。

综上所述，葱白提取物可改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能，减轻和延缓心肌纤维化的进程，其机制可能是通过抑制炎症反应和降低心肌TGF-β1、Smad2蛋白的表达来实现的。