培哚普利和螺内酯对大鼠糖尿病肾病水通道蛋白表达的影响

莫娜 王正义 童丽灵 (海口市人民医院内科，海南 海口 571100)

糖尿病肾病是常见的慢性肾脏疾病之一，会逐渐导致肾功能障碍〔1〕。糖尿病肾病常见特征是肾小球滤过屏障受损导致持续蛋白尿。临床上糖尿病肾病患者会逐渐出现蛋白尿，进而出现肾功损伤，最终导致肾衰竭〔2，3〕。糖尿病是一种常见的内分泌疾病,以往一直认为糖尿病患者多尿症状是由高血糖引起的渗透性利尿，而新近研究发现水通道蛋白(AQPs)也在其尿液浓缩过程及水代谢失调中发挥重要作用〔4〕。本研究旨在探讨培哚普利和螺内酯对糖尿病肾病AQP表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 雄性SD大鼠72只，体重(200±20)g，适应性饲养1 w，室温18～22℃，湿度50%～70%，自由饮水；培哚普利片购自施维雅天津制药有限公司，螺内酯片购自张家口云峰药业有限公司。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，尿蛋白定量试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司，肌酐试剂盒购自海通蔚生物科技有限公司，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4多克隆抗体购自上海超研生物科技有限公司。血糖仪购自美国LifeScan，酶标仪购自美国BioRad。

1.2糖尿病肾病模型制备 高脂饲料(脂肪40%、蔗糖20%、蛋白质3%与大鼠普通粉料混合)喂养4 w后，给予STZ 50 mg/kg(用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液0.1 mol/L配制一次性腹腔注射)。正常组注射等体积的柠檬酸缓冲液。于注射STZ 72 h后断尾取血测定血糖值，随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病模型制备成功。再喂养4 w，收集24 h尿液24 h尿蛋白≥30 h则说明糖尿病肾病模型制备成功。将造模成功的48只大鼠随机分为模型组、培哚普利组、螺内酯组、培哚普利联合螺内酯组各12只，正常组12只。模型组和正常组等剂量生理盐水灌胃；培哚普利组给予2 mg/(kg·d)培哚普利灌胃；螺内酯组给予50 mg/(kg·d)螺内酯灌胃；培哚普利联合螺内酯组给予2 mg/(kg·d)培哚普利+50 mg/(kg·d)螺内酯灌胃。连续8 w。

1.3方法 于结束前1 d，采取且计算24 h尿量；腹腔主动脉取血，离心，1 500 r/min，分离血清标本，置于-20℃下保存待测。取上述血清标本测定空腹血糖(FPG)。采用酶法测定血肌酐含量；取上述尿液标本，离心，去除沉渣，采用邻苯三酚红/钼酸盐法测定24 h尿蛋白量。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量。Western印迹测定AQP1、AQP2、AQP3、AQP4蛋白表达：给予大鼠50 mg/kg 1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，取肾脏髓质，于-70℃下保存待测。用蛋白裂解液提取组织总蛋白，采用考马斯亮蓝蛋白定量，采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后将其转移蛋白到硝酸纤维素膜上。采用5%脱脂奶粉封闭，加入AQP1、AQP2、AQP3、AQP4多克隆抗体(1∶200)孵育，放置于4℃下过夜。再加入二抗(1∶2 000)孵育2 h。以电化学发光(ECL)法显影，图像扫描后，再以Quantitiy one图像分析软件分析条带灰度。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1各组FPG比较 模型组FPG水平〔(26.52±4.32)mmol/L〕、培哚普利组〔(14.39±2.12)mmol/L〕、螺内酯组〔(13.98±1.97)mmol/L〕和培哚普利联合螺内酯组〔(11.41±1.38)mmol/L〕显著高于正常组〔(9.32±1.20)mmol/L，P<0.05〕；培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组FPG显著低于模型组(P<0.05)；培哚普利联合螺内酯组FPG显著低于培哚普利组、螺内酯组(P<0.05)。

2.2各组血肌酐和24 h尿蛋白量比较 模型组、培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组血肌酐和24 h尿蛋白量显著高于正常组(P<0.05)；培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组血肌酐和24 h尿蛋白量显著低于模型组(P<0.05)；培哚普利联合螺内酯组血肌酐和24 h尿蛋白量显著低于培哚普利组、螺内酯组(P<0.05)。见表1。

表1 各组血肌酐和24 h尿蛋白量比较

与正常组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；与培哚普利组和螺内酯组比较:3)P<0.05;下表同

2.3各组尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量比较 模型组、培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量显著高于正常组(均P<0.05)；培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量显著低于模型组(均P<0.05)；培哚普利联合螺内酯组尿液AQP1、AQP2、AQP3、AQP4含量显著低于培哚普利组、螺内酯组(均P<0.05)。见表2。

组别AQP1AQP2AQP3AQP4正常组14.38±2.2917.92±1.9723.14±4.5612.31±2.04模型组41.32±6.781)38.63±3.251)51.32±6.981)29.42±3.871)培哚普利组27.81±4.251)2)26.14±2.081)2)37.82±5.491)2)20.19±3.251)2)螺内酯组28.19±5.101)2)25.43±3.291)2)36.90±5.211)2)20.56±3.011)2)培哚普利联合螺内酯组19.15±2.571)2)3)20.19±1.421)2)3)29.37±3.261)2)3)15.42±2.311)2)3)

2.4各组肾组织AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表达比较 模型组、培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表达灰度值显著高于正常组(均P<0.05)；培哚普利组、螺内酯组和培哚普利联合螺内酯组AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表达灰度值显著低于模型组(均P<0.05)；培哚普利联合螺内酯组AQP1、AQP2、AQP3、AQP4表达灰度值显著低于培哚普利组、螺内酯组(均P<0.05)。见表3。

组别AQP1AQP2AQP3AQP4正常组0.17±0.030.25±0.040.19±0.020.13±0.03模型组0.61±0.141)0.56±0.081)0.51±0.101)0.53±0.121)培哚普利组0.37±0.071)2)0.40±0.051)2)0.35±0.061)2)0.31±0.061)2)螺内酯组0.38±0.091)2)0.39±0.081)2)0.36±0.081)2)0.32±0.071)2)培哚普利联合螺内酯组0.25±0.051)2)3)0.31±0.031)2)3)0.25±0.031)2)3)0.21±0.091)2)3)

3 讨 论

随着近年来人们饮食结构和生活水平的不断改善，糖尿病发病率呈不断上升趋势，严重影响人们生活质量〔5,6〕。糖尿病肾病是糖尿病重要的一种并发症，且导致糖尿病死亡的主要原因之一〔7〕。但目前对糖尿病肾病具体发病机制尚不十分明确。培哚普利和螺内酯分别作为肾素-血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和醛固酮抑制剂，前者主要通过阻断肾素-血管紧张素系统使醛固酮分泌减少，增加钠的排出，同时降低肾小球内压增加肾血流量，使尿量增加〔8～10〕。而后者螺内脂主要是通过直接抑制醛固酮，使肾小管对钠重吸收减少，排钠增加，也使尿量增加，二者对糖尿病肾病水调节代谢机制有相似之处，即通过抑制醛固酮机制〔11～13〕。本研究提示培哚普利和螺内酯可降低FPG、血肌酐和24 h尿蛋白量含量。

但培哚普利和螺内酯是否还存在对AQP的调节作用目前仍未完全阐明。近年来，位于细胞膜上的特异性水转运孔道——AQP家族的发现为研究细胞膜水通透性的分子机制提供了新的视角。研究发现AQP的表达及功能改变将会影响特定细胞膜的水转运，而各种各样的多尿症及不同形式水肿的病理生理过程均与AQP有关，同时AQP还为疾病治疗与水平衡调节的研究提供了理论基础〔14,15〕。本研究提示培哚普利和螺内酯可降低尿液及肾组织AQP含量。

综上，培哚普利和螺内酯对糖尿病肾病大鼠肾脏具有一定保护作用，且机制可能与降低尿液AQP水平及抑制肾组织AQP表达有关。