三种培养原代支气管成纤维细胞方法的比较

余思源 温冬梅 芮奎 顾延会 欧阳瑶

(遵义医科大学附属医院呼吸与危重症一病区，贵州 遵义 563100)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种高发病率、高死亡率累及气道和肺部的疾病，以气流受限为特征的〔1〕，气道重塑是其病理基础，有关COPD气道重塑机制仍未明确，也是目前 COPD治疗的难点〔2，3〕。有学者研究发现COPD的气道重塑主要发生在小支气管和直径小于2 mm的细支气管中，因此，支气管成纤维细胞的结构和功能对维持小气道正常生理功能，在调控小气道的气体流量及气体分布的功能中有重要作用〔4，5〕。COPD的气道重塑，尤其是气道纤维化，是病情持续进展和恶化的关键因素〔6〕。一方面，支气管成纤维细胞可能在COPD气道重塑机制的研究中发挥着重要的作用，另一方面原生代的支气管成纤维细胞生物学特性尚未发生改变，可以更好地反映体内的生长特性，可以用来模拟体内环境〔7〕。因此为了从细胞学和分子生物学水平进一步阐明COPD气道重塑的发生机制提供更可靠的体外细胞模型以满足体外实验研究，探索建立能够大量快速、高效获取原代支气管成纤维细胞的方法具有重要的意义。本实验采用Ⅰ型胶原酶和木瓜蛋白酶联合消化法+组织块黏附法、双酶消化法+组织黏附法、组织块黏附法分别分离大鼠支气管成纤维细胞体外培养，并参考国内外技术方法进行改进和对比，建立大鼠支气管成纤维细胞原代培养技术并鉴定细胞的纯度，为分离具有较高存活率的支气管成纤维细胞提供了良好的条件，同时也为构建COPD气道重塑的体外模型奠定了坚实的基础〔8，9〕。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级雄性 Sprague-Dawley大鼠，体重150～180 g，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。动物使用许可证号：00024737。

1.1.2主要试剂 DMEM高糖培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，BI公司)Ⅰ型胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白均购自Sigma公司。0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、4%多聚甲醛溶液、山羊血清(封闭用)、4，6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)、CCK8均购自Solarbio 公司。波形蛋白免疫荧光一抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠二抗购自BOSTER公司。细胞培养瓶、离心管、培养皿等均为NEST产品。

1.1.3主要仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(Thermo 公司)，倒置显微镜(Olympus CKX41)，酶标仪(Thermo，Multiskan MK3)。

1.2取材 颈椎脱臼法处死大鼠，在盛有75%乙醇烧杯中将其浸泡10～15 min，用镊子夹住鼠尾放入弯盘，喷洒酒精后将其放入超洁净的工作台，切开胸腔，充分暴露心肺组织。然后用镊子夹住主支气管，取出心肺组织，在含有双抗的磷酸盐缓冲液PBS中洗涤3～5次。冲洗至无血迹后弃去心脏组织，将漂洗干净的肺组织置于含有双抗的 PBS玻璃皿中。更换手术器械，用一把眼科弯镊轻轻夹住主支气管，沿着左右主支气管的走行，轻轻剥离去除肺组织。待去除大部分肺组织后用两把有齿弯平台镊子轻轻刮去支气管外层的结缔组织。用无菌眼科剪将组织剪至1～2 mm3大小。

1.3不同酶消化法+组织块贴壁法

1.3.1胶原酶联合消化液的配制 二硫苏糖醇(DTT)：7 mg，BSA：100 mg，Ⅰ型胶原酶：426.5 mg，木瓜蛋白酶：10 mg溶于50 ml D-Hank平衡盐缓冲液，混匀，0.22 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，方法参照文献〔10〕。

1.3.2酶联合消化+组织块黏附法 将剪好的支气管组织，大小为1～2 mm3，置于50 ml离心管中，再加入3～4 ml胶原酶联合消化液。置于37℃、5% CO2的孵育箱中消化。取出观察并每隔15 min震摇离心管，消化时间需30～40 min，待组织碎块消化成透明絮状物时，用 850 r/min 离心6 min，吸取沉淀物至装有3 ml含有20% FBS高糖DMEM培养液的T25培养瓶中，在培养瓶中充分将沉淀物吹打混匀，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培养。24 h后，有单个支气管成纤维细胞已贴附于培养瓶壁，收集未附着的组织块并将其贴壁于新的 T25 培养瓶中，在已经贴壁生长的细胞培养瓶中添加含20% FBS、三抗(10 000 IU/ml青霉素g钠、10 000 μg/ml硫酸链霉素、25 μg/ml两性霉素B)和1%L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养液，置于 37℃、5% CO2培养箱中继续培养，3～4 d后在倒置显微镜下观察。

1.3.3双酶消化法+组织黏附法 支气管组织剪至大小为1～2 mm3，在50 ml离心管中加入0.25%胰蛋白酶4～5 ml，并在37℃、5%CO2的孵育箱中消化10 min，期间每隔5 min震摇1次；10 min后取出离心管，弃去上清液，重新加入新的0.25%胰酶4～5 ml，将其置于37℃、5%CO2的孵育箱中8 min，每隔4 min摇动1次，观察组织是否有黏稠感，取出离心管加入3～4 mlⅠ型胶原酶，继续在37℃、5%CO2的孵育箱中消化15 min，期间每隔8～10 min震摇 1次，消化30～40 min，观察组织块成为透明絮状物时，用850 r/min离心6 min，吸取沉淀物至装有3 ml含有20% FBS高糖DMEM培养液的T25培养瓶中，在培养瓶中充分将沉淀物吹打混匀，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培养。24 h后用组织块黏附法步骤同1.3.2。

1.4组织块黏附法 将支气管组织剪成1～2 mm3小块，用弯曲的移液管将剪好的组织块贴附固定在培养瓶底部。倒置培养瓶后加入3 ml含含20% FBS、三抗(10 000 IU/ml青霉素g钠、10 000 μg/ml硫酸链霉素、25 μg/ml两性霉素B)和1%L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育(注意：培养基不应接触组织块)，3～4 h后轻轻翻转培养瓶，使组织块完全浸入培养基中并静置，尽量不要在前3 d转动培养瓶，以确保细胞顺利生长。4～5 d后在倒置显微镜下观察。

1.5大鼠支气管成纤维细胞传代及纯化

1.5.1支气管成纤维细胞传代 待细胞生长至70%～80%时，吸出培养基并用PBS洗涤细胞2～3次，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化液，在培养箱内消化2～3 min，取出培养瓶后置于镜下观察发现细胞体积变圆、成片收缩时，加入5～6 ml含10% FBS的培养液终止消化，并将细胞悬液放入10 ml离心管中850 r/min离心5 min，弃去上清液，重新添加新的培养液并重悬细胞，分装到培养瓶，置于37℃，5%CO2敷箱中培养。第二天观察传代细胞的生长状态和贴壁情况。每2～3 d换一次培养基，80%～90%汇合后传代。

1.5.2差速贴壁法纯化成纤维细胞 培养瓶里加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，放入培养箱内放置2～3 min，取出培养瓶并将其置于显微镜下观察发现细胞体积变圆、成片收缩时，通过加入5～6 ml 含10% FBS 的培养液终止消化，并将细胞悬液吸入到10 ml离心管中以850 r/min 离心5 min，弃去上清液，重新加入新的培养液吹散混匀细胞后分装到培养瓶。在培养箱中放置15 min后保留黏附的气道成纤维细胞并吸出培养液，加入新的培养液继续在37℃，5%CO2敷箱中孵育〔11〕。重复以上步骤 2～3次，贴附的几乎为成纤维细胞，细胞的形态学变化在镜下观察，并拍照记录。

1.6成纤维细胞的荧光鉴定 细胞鉴定：取第三代的细胞，以5×104/ml密度计数细胞悬液并接种到6孔板中，置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中直至细胞贴壁。取出6孔板，吸出培养基，加入4%多聚甲醛在室温下固定30～40 min，0.3% Triton-X100 室温透化破膜10 min；将山羊血清在室温下封闭30 min，弃血清后滴加一抗波形蛋白，浓度为1∶100，4℃冰箱过夜。18～24 h后将6孔板从4℃冰箱中取出复温20 min后弃一抗，避光条件下加入浓度为1∶100的FITC标记的羊抗小鼠抗体，室温避光条件下静置70 min，丢弃二抗，避光环境中加入DAPI，复染核10 min，上述操作过程每步用PBS漂洗3 min×3次，洗去DAPI后荧光显微镜下拍照〔12〕。

1.7成纤维细胞增殖曲线测定 取第3代细胞，以5×104/ml的密度计数细胞悬液接种到96孔板中，每孔为100 μl，置于37℃、5%CO2培养箱中至细胞贴壁后，予以无血清的DMEM培养液同步化24 h，隔天加入CCK8试剂10 μl/孔，37℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，通过酶标仪检测OD450 nm的值并连续检测7 d，记录并作图。

2 结 果

2.1获取支气管组织 通过颈椎脱位处死大鼠，喷洒酒精后将其置于超净工作台，切开胸腔，充分暴露出心肺组织，取出心肺组织，最后获取支气管组织块，见图1。

图1 获取支气管组织

2.2不同消化方法支气管成纤维细胞的镜下表现 酶消化法原代培养24 h换液后观察到三角形或近似梭形的细胞黏附。在第3天几乎所有细胞变成梭形，偶可见多边形细胞。在第5天细胞的胞质伸展，单层融合，细胞形态呈长梭形，纺锤状、胞质丰富，可见多数核分裂象，并聚集成团生长。第7天随着成纤维细胞的融合，细胞快速生长，细胞汇合度可达90%，衔接紧密，胞体变得细长并呈线性、放射状或栅栏状起伏，一些区域可堆叠成多层生长。见图2。

2.3组织块黏附法的镜下表现 在原代培养的第5天细胞黏附在壁上，细胞形态和大小各不相同，主要为多角形、不规则形，长梭形少见。7 d细胞变形为长纺锤形，但细胞数量较少。近14 d几乎所有细胞为长梭形，有分支状突起，丰富的胞质并且细胞平行排列成单层，成旋涡状，放射状或似栅栏状起伏或出现多个区域的重叠层。可在14 d左右传代。见图3。

图2 酶消化法培养的原代支气管成纤维细胞(×200)

图3 组织块贴壁法培养的原代支气管成纤维细胞(×200)

2.4支气管成纤维细胞传代培养 通过3种方法培养的细胞生长至70%～80%即可传代，0.25%胰蛋白酶消化后，细胞呈单个半透亮的小圆点。在1 d后变为分散长梭形贴壁细胞，3～4 d后呈放射状生长的成纤维细胞几乎填充整个培养瓶。通过时差黏附法纯化细胞，传代至第 2 代，杂细胞基本除去，细胞形态均为长梭形。因此2～4代细胞活性状态较好。

2.5鉴定支气管成纤维细胞的纯度 培养的第三代细胞行波形蛋白(Vimentin)特异性免疫荧光鉴定，经Vimentin免疫荧光细胞化学染色后，波形蛋白呈阳性表达Vimentin表达为阳性，而抗α-肌动蛋白(anti-α-SMA)染色呈阴性，培养的大鼠支气管成纤细胞阳性率达95.0%以上。细胞纯度高。见图4。

图4 第三代大鼠支气管成纤维细胞免疫荧光鉴定(×200)

2.6大鼠支气管成纤维细胞生长曲线 选取第3代支气管成纤维细胞用CCK-8检测细胞增殖活性，检测OD450 nm值并绘制生长曲线。将OD450 nm平均值作为纵坐标，培养天数为横坐标作图。第1～2天为细胞的适应期，生长相对缓慢。第3～6天是细胞的对数生长期并且生长相对较快。第6天生长达到高峰，第7天细胞进入生长平台期，细胞增殖减慢，活性下降。生长曲线近似于“S”形。见图5。

图5 第三代大鼠支气管成纤维细胞生长曲线

3 讨 论

方秋红等〔3〕成功培养出人支气管成纤维细胞并对其生物特性、功能与肺成纤维细胞做出了比较和区别，为COPD气道重塑的体外研究奠定了基础。支气管成纤维细胞是参与气道构成的主要细胞，对维护小气道功能的稳定发挥着重要的作用。一方面支气管成纤维细胞参与小气道的形成，产生细胞外基质成分，例如Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白；另一方面，支气管成纤维细胞还可以产生气道重塑过程中所需的基质金属蛋白酶、 各种生长因子和细胞因子〔14〕。气道重塑的发生与发展可能与支气管成纤维细胞的异常增殖和分泌功能障碍有关。原代细胞培养更能接近并反映了体内的生长特性，且动物取材相对人体取材更方便，因此体外培养大鼠支气管成纤维细胞对COPD气道重塑的体外研究很有必要，且提供了良好的实验基础〔15〕。本研究过程中，通过反复试验和尝试组织块黏附法、改良后的Ⅰ型胶原酶联合消化-组织块黏附法以及胰蛋白酶+Ⅰ型胶原酶消化(双酶法-贴壁组织块法)，对各种培养方法进行反复调整、改良和对比，发现胰蛋白酶+Ⅰ型胶原酶消化+贴壁组织块法(双酶法-贴壁组织块法)，操作简便，实用，经济，相比另外两种方法得到的支气管成纤维细胞数目最多且细胞活性最好。改良的特点有：①首先用0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，目的是胰蛋白酶增强间质蛋白的消化，使细胞中的蛋白质完全水解，细胞分散更快；②其次在37℃，5%CO2的培养箱中用Ⅰ型胶原酶消化细胞。目的是进一步地松解纤维组织，消化胶原纤维，使支气管成纤维细胞释放出来，且胶原酶作用温和，对细胞的损伤小。③酶消法后再继续使残留的组织块重新贴壁培养是本实验改良方法的关键。在传统的酶消化方法之后，组织块随细胞被吹散消化后，组织块仅使用一次，并且没有选择再生贴壁培养。酶消化后组织内的细胞变得松散，黏附更牢固，细胞更易游出，在缩短培养周期的同时，也提高了细胞产量，更加经济实惠。

胰蛋白酶消化预处理可部分分解细胞外基质成分，使得组织块疏松，细胞易于爬出生长；但因其酶解作用较强，可损伤细胞膜上的相应抗原及受体成分，影响细胞状态，因此选择合适的酶解浓度和时间至关重要。经过多次试验，发现胰蛋白酶浓度为2.5 g/L，胰蛋白酶消化时间15～20 min的条件下细胞爬出速度及生长状态最佳。未经胰蛋白酶预先消化时，成纤维细胞成簇爬出平均时间约为5 d，需7～9 d才能达到传代状态。在上述酶解条件下，细胞爬出平均时间提前，3～4 d，且组织块周围细胞爬出数量也明显增多，5～7 d即可传代，从而提高细胞的培养效率。本课题组也试验了单纯用胰蛋白酶消化法，发现其获取支气管成纤维细胞的效果不理想。分析失败的原因为胰蛋白酶具有较强细胞毒性，细胞膜的破坏性也较大，因此对细胞的存活有负面影响〔16〕。

目前国内外关于SD大鼠支气管成纤维培养的报道很少。组织块黏附法、酶消化法是培养原代细胞的常用方法。组织块黏附法培养细胞的优点是成本低、操作简单〔17〕；但其培养周期长，根据本实验的观察，一般需要5～7 d 方有单细胞游出，10 d左右才能融合成片，获得足够数量的细胞至少需要12～15 d 。一方面组织长期持续浸渍在温暖而又富有充足营养的培养基中为细菌和真菌的生长提供了温床，易污染。另一方面培养液不易渗透组织，导致部分组织块因缺乏营养而坏死变黑，坏死的组织产生的有害物质也可能对细胞的爬出产生不良影响。而且组织块贴壁不易附着在培养瓶上，容易脱落。此外组织块贴壁法的效率较低，爬出足够数量的原代细胞通常要花费数星期时间〔18〕。这些问题使组织块贴壁培养法不太适应于当前研究中对支气管成纤维细胞大量需求的情况。因此，相比之下，酶消化法更为高效，同时细胞产量也得到提高、具有操作简便快速、易掌握的优点，并使细胞污染的风险降低。酶消化法利用消化酶如胶原酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶的作用来破坏细胞结缔组织之间的联系，将上皮组织与结缔组织分离，并且在化学反应后进一步消化间充质组织以产生成纤维细胞悬液，最终细胞接种后可获得原代细胞。胶原酶消化法和胰蛋白酶消化法+胶原酶消化法是常规实验中使用的两种主要酶消化法〔19,20〕。

胶原酶能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其他蛋白质和组织，因此消化作用相对较温和。胶原酶可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型和专用肝细胞胶原酶。Ⅰ型和Ⅲ型胶原可在支气管成纤维细胞中合成〔21〕。促进成纤维细胞释放的关键酶是I型胶原酶，作用为使Ⅰ、Ⅲ型胶原得到充分水解。本研究利用I型胶原酶与木瓜蛋白酶联合消化，并添加BSA及DTT 辅助消化，对细胞的损伤程度减轻，使组织内的细胞更容易释放迁出并可高效快捷的获得大量的细胞。细胞接种后活力好，生长增殖能力较强，生长时间短，细胞产量高〔22〕。木瓜蛋白酶降解胶原纤维并简化蛋白质结构，使细胞更容易从组织中释放出来。蛋白质中的半胱氨酸之间形成的蛋白质分子或分子间的二硫键被DTT阻断，同时保护蛋白质中的半胱氨酸成分免受氧化，使蛋白变性发生的概率降低。BSA的加入可防止酶的分解和特异性的吸附，稳定酶的活性，防止酶失活〔10〕。在本研究中还观察到，传代次数的增加，细胞活力的降低，细胞形态的改变，主要表现为星形、三角形或扁平的多突纺锤形。原因可能是原代细胞本身的逐渐老化，随后通过多次传代导致细胞增殖能力减弱。多细胞分裂导致细胞逐渐丧失成纤维细胞的生长和分化特性，引起细胞表型的变化，从而可转变为肌成纤维细胞〔23〕。因此不建议采用4代之后的支气管成纤维细胞进行相关实验研究。

存在于中间丝的Vimentin是成纤维细胞内便于鉴定的特异性蛋白质〔24〕。它存在并在中胚层起源的细胞中表达，是间质细胞中最主要的中间纤维，提供微管和肌动蛋白不具有的特定弹性，负责维持细胞骨架的完整性〔25〕，可以根据其阳性表达鉴定支气管成纤维细胞的纯度。气道成纤维细胞在健康状态下不表达α-SMA，但在气道重塑过程中，α-SMA的表达被认为是成纤维细胞活化并分化为肌成纤维细胞的标志〔26〕。本研究免疫荧光鉴定中显示anti-α-SMA染色呈阴性，说明本课题组成功分离、培养出支气管成纤维细胞，且纯度为95%以上。

综上，改良胰蛋白酶+胶原酶联合消化法+组织块贴壁法能最大限度地利消化利用支气管组织，获得的原代支气管成纤维细胞数量最多。此法操作快捷、简便且不易污染，为COPD气道重塑的体外研究提供大量种子细胞，从细胞分子水平研究COPD气道重塑的发病机制和防治提供了体外实验基础。