巴氯芬改善慢性脑缺血大鼠情感障碍的作用及其机制*

肖敏，郭莲军，罗攀

(1.华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院神经内科，武汉 430014；2.华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系，武汉 430030；3.华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，武汉 430030)

慢性脑缺血往往会导致不可逆性脑损伤，引发一系列病理性改变。然而，缺血后情感障碍常常被人们忽略。研究表明，急性或慢性脑血管病中约40%患者会出现情感障碍，包括抑郁症状及焦虑症状[1-2]。情感障碍的产生能延缓疾病的康复，导致高致残率和致死率，严重影响患者的生活质量。研究显示，部分经典抗抑郁药并不适合缺血后治疗[3]，所以寻求有效的药物对缺血后情感障碍进行干预十分必要。

巴氯芬是一种γ-氨基丁酸亚型B(gamma-amino butyric acid type B，GABAB)受体激动药，临床上主要用作一些脑部或脊髓疾病继发的肌肉痉挛或强直的肌肉松弛药。近年来，随着研究的深入，巴氯芬在多种病理状况下显示出较好的治疗潜力[4-5]。有研究指出巴氯芬对抑郁和焦虑症状也具有一定的改善作用[6-7]。然而，巴氯芬能否改善慢性脑缺血所致的情感障碍，以及其所涉及的分子机制，目前尚未研究清楚。

本研究通过双侧颈总动脉结扎(two-vessel occlusion，2VO)建立大鼠慢性脑缺血模型，评价巴氯芬对缺血后大鼠焦虑样症状及抑郁样症状的改善作用。杏仁核是负责情感加工最重要的一个脑区。有研究指出2VO 造模后可导致杏仁核局部脑血流量降低及神经元损伤[8-9]。所以本研究进一步基于杏仁核探讨其作用的分子机制，并在细胞模型上进行论证。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 巴氯芬(上海迈瑞尔化工科技有限公司，批号：1134-47-0)，脑源性神经因子(brain-derived nerve factor，BDNF)抗体(Santa Cruz Biotechnology，批号：sc-20981)，TrkB抗体(ABclonal Technology，批号：A2099)，GAPDH(CWbiotech，批号：CW010)，BDNF酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(CSB-E04504r-1，Cusabio)，凝胶电泳仪(DYY-8C，北京六一仪器厂)，酶标仪(Elx800，Bio2tek)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco，批号：10099-141)，伊格尔改良培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，Hyclone，批号：SH30022.01)。其余试剂均为市售分析纯。

1.2实验动物、细胞及分组 实验操作过程均遵循国际卫生研究机构关于动物使用伦理学方面的原则。清洁级 SD大鼠，实验动物生产许可证号：SCXK(鄂) 2010-0009，体质量约200 g，随机分笼饲养，自由摄食饮水。环境温度保持在23～25 ℃，光照遵循自然节律。通过简单随机化分组，分为假手术组(n=12)，2VO缺血组(n=16)，2VO+巴氯芬组(n=16)，假手术+巴氯芬组(n=12)。巴氯芬给药剂量为25 mg·kg-1(溶于0.9% 氯化钠溶液中)，腹腔注射，持续给药3周，参考文献[10]，实验流程见图1。

实验用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y购自美国菌种保藏中心。用含10% FBS的DMEM培养基培养，置于37 ℃含5% 二氧化碳(CO2)的培养箱中养。实验分为正常对照组，氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型对照组，OGD+巴氯芬小剂量组(50 μmol·L-1)，OGD+巴氯芬中剂量组(100 μmol·L-1)，OGD+巴氯芬大剂量组(200 μmol·L-1)。

1.3大鼠2VO手术与细胞OGD模型 大鼠麻醉后将体温维持在36～38 °C，将两侧颈总动脉与迷走神经分离。之后对双侧颈总动脉进行双结扎，并在两个结扎点之间剪断。假手术组大鼠只分离颈总动脉，不结扎和剪断血管。SH-SY5Y细胞培养过程中将氧气用氮气替换，并用无糖培养基进行培养建立OGD模型。分别OGD 4及8 h。巴氯芬在OGD前5 min与细胞共孵育。

1.4焦虑样行为评价

1.4.1旷场实验 旷场实验装置是由一个100 cm×100 cm×40 cm的黑色敞箱组成，该敞箱上方放置一个数码摄像头，并连接到EthoVision分析系统(Noldus信息技术公司)。大鼠从敞箱中间放入，摄像头记录大鼠5 min内的活动情况并进行分析。以大鼠运动总路程评价其自发活动，大鼠在中心区域所待时间评价其焦虑症状。

1.4.2十字迷宫实验 高架十字迷宫装置是由两个开放臂(50 cm×10 cm)、两个闭合臂(50 cm×10 cm×30 cm)以及一个中央区域(10 cm×10 cm)组成十字形装置，该装置离地面50 cm。大鼠从装置中央区域放入，记录5 min内大鼠进入开放臂的次数和停留的时间，大鼠活动记录和分析系统与旷场实验相同。

1.5抑郁样行为评价

1.5.1糖水偏好实验 整个实验过程分为3个阶段：适应阶段，基准值检测阶段，以及糖水偏好检测阶段。大鼠在造模前进行糖水适应及基准值检测：将大鼠每日摄取的自来水换成1%蔗糖溶液，适应24 h。随后将大鼠分笼饲养，配对放置两个外形一样的分别含1%蔗糖的水瓶和自来水水瓶，检测期间水瓶位置相互更换一次。记录72 h内每只大鼠分别摄入的糖水量和自来水量。糖水偏好率=[糖水饮用量/(糖水饮用量+自来水饮用量)]×100%。大鼠造模后第33天进行糖水偏好检测，操作同基准值检测。检测24 h内大鼠的糖水偏好率。

图1 实验流程图

1.5.2强迫游泳实验 强迫游泳实验装置由一个高60 cm、直径20 cm的透明有机玻璃圆桶组成。圆桶注入水，温度为(25±2) ℃，深度为40 cm。实验前一天，大鼠放入圆桶中预适应10 min，实验当天大鼠再次放入圆桶中，记录5 min内大鼠的累积不动时间。

1.6Western blotting检测蛋白含量 分离各组大鼠杏仁核组织，提取总蛋白。取等量蛋白进行凝胶电泳分离后，转印至PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h后，4 ℃孵育一抗(BDNF及TrkB)12 h。第2天清洗后加入相应二抗孵育2 h。洗涤后，加入显影液显影成像。使用GAPDH抗体进行内参校正。曝光图像用Image J软件对条带灰度值进行分析。

1.7ELISA分析 收集OGD后各组细胞上清液，按照BDNF ELISA试剂盒说明书进行检测。96孔板中每孔加入待测样本100 μL，然后依次加入一抗工作液(50 μL，120 min)，酶标抗体工作液(100 μL，60 min)，底物工作液(100 μL，10 min，避光)。加入终止液100 μL后，30 min内用酶标仪在波长450 nm处测吸光度值。之后根据标准曲线转换成各孔BDNF的浓度。每组设副孔2个，实验重复4次。

2 结果

2.1巴氯芬改善慢性脑缺血大鼠焦虑样症状 结果见表1。旷场实验显示2VO及巴氯芬不影响大鼠的运动总路程，提示其自发活动不受影响。然而单因素方差分析结果显示大鼠在中央区域所待时间组间差异有统计学意义(F=4.65，P<0.01)。2VO后大鼠在中央区域所待时间明显缩短(与假手术组比较，P<0.05)，给予巴氯芬后能延长2VO所致的中央区域所待时间(与2VO模型对照组比较，P<0.05)。单因素方差分析结果显示高架十字迷宫实验中大鼠在开放臂所待时间组间差异有统计学意义(F=2.66，P<0.05)。与假手术组比较，2VO后大鼠在开放臂所待时间明显缩短(P<0.05)；与2VO模型对照组比较，给予巴氯芬后大鼠在开放臂所待时间显著延长(P<0.05)。提示巴氯芬能改善慢性脑缺血所致的焦虑样症状。

表1 4组大鼠焦虑样行为评价结果

组别大鼠/只旷场实验运动总路程/cm中央区域所待时间/s高架十字迷宫实验开放臂所待时间/s假手术组121 014.11±79.5322.36±2.4657.15±4.392VO模型对照组161 046.57±68.2915.70±1.83①42.61±3.67①2VO+巴氯芬组16960.36±78.4421.05±1.35②53.88±3.12②假手术+巴氯芬组12897.63±103.9526.13±2.6049.68±5.04

①与假手术组比较，t=2.31，2.55，P<0.05；②与2VO模型对照组比较，t=2.02，2.13，P<0.05。

①Compared with sham operation group，t=2.31，2.55，P<0.05；②Compared with 2VO model group，t=2.02，2.13，P<0.05.

2.2巴氯芬改善慢性脑缺血大鼠抑郁样症状 结果见表2。在2VO手术前各组大鼠的糖水偏好率无明显差异；而2VO手术后，单因素方差分析结果显示糖水偏好率组间差异有统计学意义(F=2.92，P<0.05)。 与假手术组比较，2VO大鼠糖水偏好率明显降低(P<0.01)；与2VO模型对照组比较，给予巴氯芬干预2VO大鼠糖水偏好率的下降能得到改善(P<0.05)。同样，强迫游泳实验单因素方差分析结果显示不动时间组间差异有统计学意义(F=2.69，P<0.05)，与假手术组比较，2VO后大鼠的累积不动时间显著延长(P<0.05)；与2VO模型对照组比较，给予巴氯芬后能缓解该时间的延长(P<0.05)。提示巴氯芬能改善慢性脑缺血所致的抑郁样症状。

表2 4组大鼠抑郁样行为评价结果

组别大鼠/只糖水偏好实验基准糖水偏好率/%检测糖水偏好率/%强迫游泳实验累积不动时间/s假手术组1293.76±1.6490.99±2.2028.58±3.632VO模型对照组1693.05±1.3173.17±5.88①45.19±5.12②2VO+巴氯芬组1692.88±1.8186.01±4.01③32.69±3.17③假手术+巴氯芬组1291.93±1.5984.68±3.8632.17±6.28

①与假手术组比较，t=2.76，P<0.01；②与假手术组比较，t=2.51，P<0.05；③与2VO模型对照组比较，t=2.15，2.05，P<0.05。

①Compared with sham operation group，t=2.76，P<0.01；②Compared with sham operation group，t=2.51，P<0.05；③Compared with 2VO model control group，t=2.15，2.05，P<0.05.

2.3巴氯芬改善慢性脑缺血大鼠杏仁核中BDNF及TrkB蛋白表达的下调 慢性脑缺血后大鼠杏仁核中神经营养因子BDNF及受体TrkB的表达见图2 。单因素方差分析显示：BDNF组间差异有统计学意义(F=6.54，P<0.05)，TrkB组间差异有统计学意义(F=3.38，P<0.05)。 与假手术组比较，2VO手术后大鼠杏仁核中BDNF及TrkB的表达显著下调(BDNF：t=2.99，P<0.01，TrkB：t=2.44，P<0.05)；与2VO模型对照组比较，给予巴氯芬干预后能缓解杏仁核中BDNF及TrkB的表达下调(BDNF：t=2.43，P<0.05，TrkB：t=2.39，P<0.05)。

A.假手术组；B.2VO模型对照组；C.2VO+巴氯芬组；D.假手术+巴氯芬组。①与假手术组比较，t=2.99，P<0.01；②与2VO模型对照组比较，t=2.43，2.39，P<0.05；③与假手术组比较，t=2.44，P<0.05。

A.Sham group；B.2VO model group；C.2VO+ baclofen group；D.Sham operattion baclofen group；①Compared with sham operattion group，t=2.99，P<0.01；② Compared with the 2VO model group，t=2.43，2.39，P<0.05； ③Compared with sham operattion group，t=2.44，P<0.05.

2.4巴氯芬改善SH-SY5Y细胞OGD后BDNF分泌的减少 为进一步探讨巴氯芬对缺血后BDNF的影响，采用ELISA实验技术在细胞水平上检测了不同剂量巴氯芬对OGD处理后SH-SY5Y细胞BDNF分泌的影响。结果见表3。单因素方差分析显示OGD 4 h组间差异有统计学意义(F=4.10，P<0.05)，OGD 8 h组间差异有统计学意义(F=14.21，P<0.01)。与正常对照组比较，OGD后SH-SY5Y细胞BDNF的分泌显著减少(OGD 4 h：P<0.05；OGD 8 h：P<0.01)；与OGD模型对照组比较，给予巴氯芬中、大剂量能显著抑制SH-SY5Y细胞BDNF分泌减少(P<0.05或P<0.01)。

表3 5组SH-SY5Y细胞BDNF含量比较

组别OGD 4 hOGD 8 h正常对照组1.00±0.061.00±0.04OGD模型对照组0.82±0.05①0.69±0.02②OGD+巴氯芬 小剂量组0.85±0.020.74±0.03 中剂量组0.96±0.05③0.79±0.02③ 大剂量组1.01±0.03④0.81±0.03③

①与正常对照组比较，t=2.89，P<0.05；②与正常对照组比较，t=6.93，P<0.01；③与OGD模型对照组比较，t=2.31，2.14，2.77，P<0.05；④与OGD模型对照组比较，t=3.10，P<0.01。

①Compared with the normal control group，t=2.89，P<0.05； ② Compared with the normal control group，t=6.93，P<0.01； ③Compared with the OGD model group，t=2.31，2.14，2.77，P<0.05； ④Compared with the OGD model group，t=3.10，P<0.01.

3 讨论

近年来，脑缺血后情感障碍的产生越来越引起重视。研究表明改善脑缺血后焦虑或者抑郁症状对脑缺血的预后治疗非常重要[11]。所以寻找有效的药物对脑缺血后情感障碍进行干预十分必要。

旷场实验和高架十字迷宫实验是评价动物焦虑样行为最常用的方法。抑郁样症状最主要的表现特征是快感缺乏和行为绝望，动物实验中分别常用糖水偏好实验和强迫游泳实验评价。通过以上行为学实验检测发现，巴氯芬能改善慢性脑缺血后大鼠出现的焦虑样与抑郁样症状。这与之前文献报道巴氯芬对多种模型的抑郁或焦虑症状有改善作用相一致[6-7]。巴氯芬的药理作用主要与其激活GABAB受体有关。事实上，其他 GABAB受体的激活剂或变构调节剂也被报道对抑郁或焦虑症状有改善作用[12- 13]。神经营养假说是情感障碍发生最重要的一种假说。研究表明：BDNF可能是连接情感障碍与心脑血管疾病之间的桥梁[14]。而GABAB受体对神经营养因子BDNF的分泌起重要调控作用[15]，给予巴氯芬也被证实能促进多种神经营养因子包括BDNF的分泌和表达[16]。这与本研究结果巴氯芬能上调缺血后大鼠杏仁核BDNF及其受体TrkB的表达相对应。提示巴氯芬可能通过作用BDNF-TrkB信号通路改善脑缺血后情感障碍的产生。

综上所述，巴氯芬可改善慢性脑缺血引起的焦虑样症状和抑郁样症状，其机制可能是通过作用于BDNF-TrkB信号通路而发挥的。并且巴氯芬作为GABAB受体激动剂有望同时改善脑缺血引起的兴奋抑制失衡，使其对脑缺血后的治疗更具优势。