丙泊酚联合热毒宁注射液对内毒素所致大鼠急性肺损伤及ERK1/2-NF-κB通路的影响

李晓峰，李英杰，佟 凯

内毒素是急性肺损伤进展的重要诱因，通过抑制中性粒细胞积聚，阻碍介质释放，减缓血小板聚集，抑制髓过氧化物酶及中性粒细胞胞外陷阱活性而加剧急性肺损伤[1-3]。脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)可诱导中性粒细胞浸润和促炎细胞因子积累，扩增急性肺炎[4]核转录因子-κB(NF-κB)及MAPK家族成员ERK1/2是促炎基因表达的重要调节因子。研究表明，LPS与Toll样受体4的结合导致NF-κ B 的抑制蛋白IκB-α磷酸化和降解，激活磷酸化ERK1/2及NF-κB，并且导致肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-6等促炎介质释放[5]。

丙泊酚为烷基酸类的短效静脉麻醉药[6],能使颅内压降低、脑耗氧量及脑血流量减少。热毒宁注射液可抑制TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化和NF-κB的激活[7-8]。本研究探讨了丙泊酚联合热毒宁注射液对内毒素所致大鼠急性肺损伤及ERK1/2-NF-κB通路的影响，旨在为急性肺损伤的治疗提供理论依据。现报告如下。

1 材料和方法

1.1实验动物分组及染毒 选取Sprague-Dawley大鼠100只，购自吉林大学实验动物中心，8周龄，体重(200.3±20.1)g，实验动物生产许可证号：SCXK(吉) 2017-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(吉) 2017-0013，实验动物质量合格证号：20180375。大鼠饲养环境为昼夜循环(12/12 h)，室温(22±1)℃。将大鼠随机分为对照组、模型组、丙泊酚组、热毒宁组、联合组，每组20只，雌雄各半。

1.2实验药物、试剂与仪器 丙泊酚注射液(Fresenius Kabi AB公司，批号：625474)，热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司，批号：20180319)；大肠杆菌055∶B5的LPS(美国Sigma-Aldrich公司，批号：S54742)；IL-2、IL-6、TNF-α试剂盒均购自美国R&D公司，批号：KIT415987、KIT254987、KIT148965)；ERK1/2、NF-κB一抗、辣根过氧化物酶缀合的抗人二抗(美国Santa Cruz公司，批号：SC0617、SC0639、SC0826)；ERK1/2、NF-κB多克隆抗体探测膜(英国Abcam公司，批号：ab65137、ab63157)；Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒、高容量RNA-to-cDNA试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司，批号：180423]；Trizol试剂(美国Invitrogen公司，批号：C7349)；RIPA缓冲液(美国赛默飞世尔公司，批号：45965)；10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶、聚偏二氟乙烯膜(上海碧云天生物技术有限公司，批号：56987、54155)；ABI PRISM 7900序列检测系统(美国ABI公司)；HX-100E小动物呼吸机(中国成都泰盟科技有限公司)；BU-90Odyssey红外线成像系统(美国LI-COR公司)；XU-8化学发光成像系统(日本奥林巴斯公司)；VC-JN12凝胶图像处理系统(美国热电公司)。

1.3动物模型的制备 模型组、丙泊酚组、热毒宁组、联合组腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，各组大鼠通过腹腔内注射来自大肠杆菌055∶B5的LPS 10 mg/kg诱导大鼠急性肺损伤模型。大鼠麻醉苏醒后口唇灰紫，精神萎靡，皮毛耸立说明急性肺损伤模型建立成功[9]。丙泊酚组大鼠腹腔注射丙泊酚注射液50.0 mg/kg，热毒宁组大鼠腹腔注射热毒宁注射液50.0 mg/kg，联合组大鼠腹腔注射丙泊酚50.0 mg/kg和热毒宁注射液50.0 mg/kg；对照组和模型组大鼠给予等体积生理盐水，均持续给药7 d。

1.4肺/体重测定及肺损伤评估 第7天颈椎脱臼处死大鼠后取右肺组织，测定大鼠湿肺/体重；随后取右肺部分组织进行常规染色切片，并在显微镜下阅片，根据肺泡内充血、肺间质水肿、中性粒细胞浸润、肺泡水肿进行评分：极重度改变为4分、重度改变为3分、中度改变为2分、轻度改变为1分、无改变或非常轻微改变为0分，累计上述4项的总分即为肺损伤评分。

1.5各组大鼠肺组织ERK1/2和NF-κB mRNA表达水平 采用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在ABI PRISM 7900序列检测系统中进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)扩增。用Trizol试剂根据制造商的方案提取大鼠肺组织总RNA。使用500 ng RNA及高容量RNA-to-cDNA试剂盒进行逆转录。ERK1/2 mRNA的引物序列如下：正向：5'GCCTCCTCAAAAGAGAGTGGAAG3'，反向：5'TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG3'。NF-κB mRNA的引物序列：正向：5'GCCGTGAGAAGCTTTCCACTC3'，反向：5'TTAAGGTTGGCTTCAGGCTCAA3'。GAPDH正向：5'ACGGATTTGGTCGTATTGGG3'，反向：5'TGATTTTGGAGGGATCTCGC3'。将ERK1/2和NF-κB mRNA的相对表达标准化为GAPDH。qRT-PCR反应体系如下：cDNA，1 μl；双蒸水，3.4 μl；提示绿色qPCR SuperMix，5 μl；被动参比染料(×50)，0.2 μl；正向引物(10 μmol/L)，0.2 μL；反向引物(10 μmol/L)，0.2 μl。系统的总体积为10 μl。在所有40个循环中，反应条件首先是95℃持续35 s，最后是60℃持续30 s。同时，构建了65℃～95℃的溶解度曲线，结果表示为均数±标准差和比较定量阈值循环(ΔΔCt)方法。

1.6各组大鼠肺组织ERK1/2和NF-κB蛋白表达水平 PAB处理肺组织匀浆24 h后，用RIPA缓冲液收集肺组织匀浆裂解物，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，然后电化学转移到聚偏二氟乙烯膜上。用针对鼠ERK1/2、NF-κB(1∶1000稀释)、鼠多克隆抗体探测膜(1∶1000稀释)、(ERK1/2)/GAPDH(1∶1000)、NF-κB/GAPDH(1∶1000)抗体在4℃下过夜。在与辣根过氧化物酶缀合的抗人二抗(1∶5000)在室温下孵育1 h后，通过使用BU-90Odyssey红外成像系统显现印迹。在同一膜上检测β-actin用作上样对照，用XU-8化学发光成像系统检测目标条带并通过VC-JN12凝胶图像处理系统分析，将蛋白质表达水平相对于β-actin标准化。

1.7各组大鼠肺组织IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平 称取大鼠右肺组织，制成匀浆，收集上清液，ELISA法检测IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平。

2 结果

2.15组大鼠肺/体比值、肺损伤评分比较 与对照组比较，模型组肺/体比值、肺损伤评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组肺/体比值、肺损伤评分显著降低，且联合组肺/体比值、肺损伤评分低于丙泊酚组和热毒宁组(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠肺/体比值、肺损伤评分比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与丙泊酚组比较，eP<0.05；与热毒宁组比较，gP<0.05

2.25组大鼠右肺组织形态学变化 对照组未见显著肺泡破化，无中性粒细胞浸润，无胶原蛋白沉淀。模型组肺泡严重破化，肺泡壁显著增厚，较多胶原蛋白沉淀于肺间质，中性粒细胞浸润显著。丙泊酚组、热毒宁组肺泡破坏程度较模型组轻，有较多中性粒细胞浸润。联合组肺泡结构基本正常，有少量中性粒细胞浸润，几乎无胶原蛋白沉淀。见图1。

图1 5组大鼠右肺组织病理形态(HE×400)

A.对照组；B.模型组；C.丙泊酚组；D.热毒宁组；E.联合组

2.35组大鼠肺ERK1/2和NF-κB mRNA表达水平比较 与对照组比较，模型组ERK1/2和NF-κB mRNA表达均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组ERK1/2和NF-κB mRNA表达水平显著降低，且联合组低于丙泊酚组和热毒宁组(P<0.05)。见表2。

2.45组大鼠肺ERK1/2和NF-κB 蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组ERK1/2和NF-κB 蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组ERK1/2和NF-κB 蛋白表达水平显著降低，且联合组低于丙泊酚组和热毒宁组(P<0.05)。见表3和图2。

2.55组大鼠肺IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较 与对照组比较，模型组IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著降低,联合组低于丙泊酚组和热毒宁组(P<0.05)。见表4。

3 讨论

急性肺损伤引起的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是重症监护中患者死亡发生的主要原因。ARDS由促炎细胞因子的释放、粒细胞和单核细胞向肺内的募集引起，导致肺血管通透性增加。目前，ARDS唯一有效的治疗方法是保护性机械通气；因此，迫切需要开发用于治疗ARDS的药物。既往文献报道，热毒宁注射液可降低卵清蛋白致敏哮喘小鼠血清的IL-6和TNF-α水平；热毒宁注射液也具有抗氧化特性，可抑制大鼠心肌细胞缺血/再灌注诱导的抗氧化蛋白超氧化物歧化酶-2和硫氧还蛋白的表达[10-11]。在缺氧/再氧合诱导的新生儿心肌细胞损伤中，热毒宁注射液通过降低脂质过氧化和增强抗氧化活性来保护心肌细胞[12]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组肺/体比值、肺损伤评分显著升高；与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组肺/体比值、肺损伤评分显著降低，且联合组上述指标低于丙泊酚组和热毒宁组；这提示丙泊酚、热毒宁注射液均可减轻内毒素所致大鼠急性肺损伤，且丙泊酚联合热毒宁注射液时效果更好。本研究结果同时显示，丙泊酚组、热毒宁组肺泡破坏程度较模型组轻，有较多中性粒细胞浸润；联合组肺泡结构基本正常，有少量中性粒细胞浸润，几乎无胶原蛋白沉淀；这说明，丙泊酚联合热毒宁注射可减轻内毒素所致大鼠急性肺损伤引发的炎症反应。

过量炎性细胞因子如TNF-α、IL-6的产生在急性肺损伤中发挥关键作用，然而，TNF-α和IL-6基因的表达依赖于转录的激活。ERK1/2包含一系列转录因子，其作为促炎介质的调节剂具有重要作用；ERK1/2的激活需要抑制蛋白ERK1/2-α的磷酸化水解，抑制ERK1/2-α2的激活可有效抑制体内炎症反应[13-14]。NF-κB家族包括p65(RelA)、p50/p105(NF-κB1)、p52/p100(NF-κB2)、RelB和c-Rel，在细胞质中作为同源二聚体或异二聚体存在，并通过结合维持无活性状态到IκB蛋白。在LPS或促炎细胞因子刺激后，IκB蛋白通过激活IκB激酶而被磷酸化并降解，导致活化，然后NF-κB易位到细胞核中，从而上调炎症基因的转录[15-17]。NF-κB的激活是动物内毒素诱导的急性非损伤发展的关键。在一项血管紧张素转换酶Ⅱ(ACEⅡ)对LPS诱导的大鼠肺损伤实验中，大鼠肺过表达ACEⅡ可显著抑制LPS诱导的ERK1/2-NF-κB磷酸化和增强IκBα表达，这一结果可由ACEⅡ抑制剂完全逆转[18]；与ACEⅡ过表达相反，沉默ACEⅡ显著增强LPS诱导的NF-κBp50/p65活化和IκBα降解。表明抑制ERK1/2-NF-κB炎症通路对于LPS诱导的急性肺损伤具有保护作用。本研究结果显示，与对照组比较，模型组ERK1/2和NF-κB mRNA、ERK1/2和NF-κB 蛋白表达水平显著升高；与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组ERK1/2和NF-κB 的mRNA表达水平、ERK1/2和NF-κB 的蛋白表达水平明显降低，且联合组低于丙泊酚组、热毒宁组。说明丙泊酚联合热毒宁注射液可抑制ERK1/2和NF-κB mRNA表达水平、ERK1/2和NF-κB蛋白表达水平，从而抑制内毒素所致大鼠急性肺损伤引发的炎症反应。本研究同时探讨了丙泊酚、热毒宁注射液对于ERK1/2、NF-κB信号通路下游炎性因子的影响。结果表明，与模型组比较，丙泊酚组、热毒宁组、联合组IL-2、IL-6和TNF-α蛋白表达水平明显降低，且联合组低于丙泊酚组、热毒宁组。与上述文献报道一致。

表2 5组大鼠肺ERK1/2和NF-κB mRNA表达水平比较

注：NF-κB为核转录因子-κB;与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与丙泊酚组比较，eP<0.05；与热毒宁组比较，gP<0.05

表3 5组大鼠肺ERK1/2和NF-κB蛋白表达水平比较

注： NF-κB为核转录因子-κB;与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与丙泊酚组比较，eP<0.05；与热毒宁组比较，gP<0.05

图2 5组大鼠肺ERK1/2、NF-κB 蛋白表达情况

A.对照组；B.模型组；C.丙泊酚组；D.热毒宁组；E.联合组；NF-κB为核转录因子-κB

表4 5组大鼠肺IL-2、IL-6、TNF-α蛋白表达水平比较

注：IL-2为白介素-2，IL-6为白介素-6，TNF-α为肿瘤坏死因子-α；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与丙泊酚组比较，eP<0.05；与热毒宁组比较，gP<0.05

综上所述，丙泊酚联合热毒宁注射液可减轻内毒素所致大鼠急性肺损伤引发的炎症反应；其机制与丙泊酚联合热毒宁注射液抑制ERK1/2-NF-κB通路基因蛋白及其下游炎性因子的表达有关。