Akt/NF-κB信号通路介导NSC23766预先处理对呼吸机相关性肺炎大鼠内皮功能的保护作用

徐 冬，余 健 ，陈 勇，薛 翠，宋玲英，陈 琳，孔天翔

机械通气是临床上为患者提供呼吸支持的常用重要治疗手段，可以维持气道通畅，但其使用不当时出现的气压伤、容积伤、切应力伤及生物性损伤等均会引起肺组织损伤，造成呼吸机相关性肺损伤(ventilator-induced lung injury，VILI)[1]。研究显示[2]，VILI损伤与肺血管内皮细胞的结构和功能改变密切相关，内皮功能受损后，可引起肺动脉高压、微循环障碍、动脉粥样硬化等多种病理生理变化。核转录因子-κB(NF-κB)信号通路是细胞内调节炎性因子的最重要细胞因子，参与调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)等多种炎性因子的表达，在VILI损伤的发生发展中发挥了重要作用[3]。近年来的研究显示，Rac 1抑制剂可以抑制经由Akt介导的NF-κB信号通路，调节细胞内炎症反应，保护VILI大鼠肺组织损伤[4]，但其对肺血管内皮细胞的作用尚不清楚。因此，本研究基于Akt/NF-κB信号通路探讨了Rac 1抑制剂NSC23766预先处理对VILI大鼠内皮功能的保护作用及机制，旨在为VILI的治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器 7500 RT-PCR系统购自于美国Applied Biosystems；电子天平(型号AUW220D，感量0.1 g)购自日本岛津公司；小动物呼吸机(HX-101E)购自成都泰萌有限公司；IL-1β、IL-10和TNF-α试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司；一氧化氮(NO)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司；内皮素-1(ET-1)检测试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)引物由上海生工生物工程有限公司合成；辣根过氧化酶(HRP)标记兔抗鼠IgG，购自北京中杉金桥生物技术公司；β-actin鼠单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体丝/苏氨酸激酶(Akt)、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65，均购自美国Abcam公司。

1.2实验动物 选取SPF级SD雄性大鼠36只，体重均为200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK(京)2015-0001，饲养于本院动物中心实验室，保持室温恒定为25℃，模拟昼夜光照，自由摄食与饮水。

1.3动物造模及给药方法 大鼠预饲养1周后，随机分为对照组、模型组和NSC23766组，每组12只。模型组和NSC23766组大鼠采用大潮气量法复制VILI模型[5]， 2%戊巴比妥钠溶液2 ml/kg腹腔注射进行麻醉，常规消毒皮肤，于大鼠颈部正中做一切口，暴露气管，行气管插管术，连接至小动物呼吸机，设置呼吸机参数：呼气末正压为0，呼吸频率为40/min，氧气浓度为21%，呼吸比为1∶1，潮气量为40 ml/kg。对照组只行气管切开，保留自主呼吸。大鼠在连接呼吸机前，NSC23766组经气管导管滴入NSC23766(1.5 mg/kg)预处理1 h，模型组和对照组经气管导管滴入等体积生理盐水预处理1 h。机械通气4 h后处死大鼠，结扎左肺门，用预冷PBS反复灌洗右侧肺泡，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，收集血液、BALF和左肺组织备用。

1.4大鼠肺组织病理学 取各组大鼠左肺下叶组织，滤纸吸干表面水分，采用电子天平称取湿重后，置入75℃恒温烤箱中烘烤3 d至恒重，称取干重，计算湿重/干重(W/D)值。取大鼠左肺中叶组织，采用4%多聚甲醛固定，进行常规的脱水、透明、包埋和切片，进行苏木精/伊红(HE)染色，于光镜下观察肺组织的病理变化，每张切片随机取5个视野拍照。

1.5大鼠BALF中相关指标检测 取各组大鼠BALF，离心(2000 r/min，10 min)，采用酶联免疫吸附法检测IL-1β、IL-10、TNF-α水平，严格按试剂盒说明书进行测定；采用考马斯亮蓝染色法检测BALF中总蛋白水平；采用细胞计数法检测BALF中白细胞(WBC)数量。

1.6大鼠肺组织中NO和ET-1的检测 取各组大鼠肺组织0.1 g，加入0.1 ml生理盐水，匀浆，离心(3000 r/min，10 min)，取上清，采用硝酸还原酶法测定NO水平，放射免疫直接测定法检测ET-1水平，严格按试剂盒说明书进行测定。

1.7大鼠肺组织中iNOS和eNOS mRNA表达水平 采用荧光定量PCR(RT-PCR)检测iNOS和eNOS mRNA水平，取肺组织0.1 g，加入0.1 ml生理盐水，匀浆，采用Trizol裂解液提取总RNA，经紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，经反转录试剂盒合成cDNA，进行RT-PCR反应，iNOS上游引物：5'-TAGAGGAACATCTGGCCAGG-3'，下游引物：5'-TGGCCGACCTGATGTTGCCA-3'；eNOS上游引物：5'-ATCCTGGCAGCCCTAAGACC-3'，下游引物：5'-TGGTAGCGTTGCTGATCCCG-3'，以GAPDH为内参，计算各组iNOS和eNOS mRNA的相对表达量。

1.8Akt/NF-κB信号通路的表达 采用Western Blot法检测，取肺组织，匀浆，采用细胞裂解液直接提取总蛋白检测Akt和NF-κB p65的磷酸化水平，采用BCA法进行蛋白定量，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜，室温密封2 h，采用TBST洗膜并加一抗Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65(稀释比例均为1∶500)，于4℃孵育过夜，TBST洗膜加HRP标记的二抗(稀释比例为1∶1000)，于室温下孵育2 h。再用ECL化学发光显示，收集影像，用凝胶图像处理系统分析对比条带强弱，选用β-actin作为内参。

2 结果

2.13组大鼠肺组织的病理变化 对照组大鼠肺组织细胞结构完整，未见明显病理变化。模型组大鼠肺组织可见肺泡结构紊乱，肺泡腔融合变大，伴大量炎性细胞浸润。NSC23766组大鼠的肺组织病理损伤较模型组大鼠明显减轻，炎性细胞浸润明显减少。见图1。对照组、模型组和NSC23766组大鼠肺组织的W/D值分别为4.21±0.41、5.46±0.52、4.72±0.43。与对照组比较，模型组大鼠肺组织W/D值显著升高(P<0.05)；与模型组相比，NSC23766组大鼠肺组织W/D值显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 3组大鼠肺组织的病理变化(HE×200)

2.23组大鼠BALF中总蛋白和WBC比较 与对照组相比，模型组和NSC23766组大鼠BALF中总蛋白和WBC数值显著增高，且模型组高于NSC23766组(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠BALF中总蛋白和WBC比较

注：BALF为支气管肺泡灌洗液，WBC为白细胞；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

2.33组大鼠BALF中炎性因子比较 与对照组相比，模型组和NSC23766组大鼠BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著升高，且模型组高于NSC23766组(P<0.01)。见表2。

表2 3组大鼠BALF中炎性因子比较

注：BALF为支气管肺泡灌洗液，IL-1β为白介素-1β，IL-6为白介素-6，TNF-α为肿瘤坏死因子-α；与对照组比较，bP<0.01；与模型组比较，dP<0.01

2.43组大鼠肺组织NO和ET-1水平比较 与对照组相比，模型组和NSC23766组大鼠肺组织中NO和ET-1水平显著升高，且模型组高于NSC23766组(P<0.05)。见表3。

2.53组大鼠肺组织iNOS和eNOS mRNA表达水平比较 与对照组相比，模型组和NSC23766组大鼠肺组织中iNOS mRNA表达水平升高，且NSC23766组低于模型组(P<0.01)。与对照组相比，模型组和NSC23766组大鼠肺组织eNOS mRNA表达水平下降，且NSC23766组高于模型组(P<0.01)。见表4。

表3 3组大鼠肺组织NO和ET-1表达水平比较

注：NO为一氧化氮，ET-1为内皮素-1；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

表4 3组大鼠肺组织iNOS和eNOS mRNA水平比较

注：iNOS为诱导型一氧化氮合酶，eNOS内皮型一氧化氮合酶；与对照组比较，bP<0.01；与模型组比较，dP<0.01

2.63组大鼠肺组织Akt/NF-κB表达水平比较 与对照组相比，模型组和NSC23766组大鼠肺组织中p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表达水平明显升高，且模型组高于NSC23766组(P<0.01)。见图2和表5。

图2 3组大鼠肺组织Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达水平

表5 3组大鼠肺组织p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表达水平比较

注：与对照组比较，bP<0.01；与模型组比较，dP<0.01

3 讨论

VILI是机械通气的严重并发症，主要表现为肺血管内皮细胞损伤、血管通透性增加、肺水肿等，临床尚无治疗的特效药物[6]；研究VILI发生发展的机制，对其治疗和预防具有重要意义。文献报道示，Rac 1抑制剂NSC23766可调节机体重要的NF-κB炎症信号通路，保护肾组织细胞损伤[7]，但对VILI内皮功能的影响报道较少。目前临床常用较大潮气量、较高通气压力、破坏肺表面活性物质等方法来复制VILI动物模型，其中较大潮气量法较常用且操作简单[8]。故本研究采用较大潮气量法复制大鼠VILI模型，分析NSC23766预处理对VILI大鼠血管内皮功能的影响。W/D值可反映肺组织的含水量变化，临床常用其反映肺水肿严重程度[9]，本研究结果显示，NSC23766组大鼠肺组织W/D值低于模型组，提示NSC23766预处理可减轻VILI大鼠肺组织水肿，保护肺组织。BALF中总蛋白和WBC数值反映了肺组织毛细血管的通透性变化和肺组织的炎性因子水平[10]，IL-1β、IL-6和TNF-α均为活化的单核/巨噬细胞合成并分泌的致炎因子，可诱导多种炎性介质产生，参与肺组织损伤后的细胞水肿、炎症反应、细胞凋亡等病理过程，加重肺组织损伤[11-12]。本研究结果显示，NSC23766组大鼠BALF中总蛋白、WBC数值、IL-1β、IL-6和TNF-α低于模型组。提示NSC23766预处理可以降低毛细血管通透性并抑制炎性因子释放，保护肺组织，减轻肺损伤。

本研究结果显示，NSC23766组eNOSmRNA高于模型组，NO、EF-1、iNOSmRNA低于模型组，提示NSC23766预处理干预可以促进肺组织eNOS的表达，抑制iNOS的表达，降低VILI大鼠肺组织ET-1和NO水平，且随着浓度升高，其作用逐渐增强。iNOS和eNOS是合成NO的关键限速酶，其中eNOS合成的低浓度NO可以抑制ET-1的分泌，发挥其扩血管、抑制血管平滑肌增殖的生物效应，而在炎性因子等刺激下活化的iNOS可产生大量的NO，过量的NO具有细胞毒性作用，可以诱导血管内皮细胞损伤[13]。ET-1和NO是由血管内皮细胞分泌的调节血管舒缩的细胞因子，ET-1可以促进血管平滑肌增殖，诱导血管内皮细胞损伤[14]。左艇等[15]报道，NO和ET-1水平变化与肺血管内皮细胞损伤密切相关，提示NSC2766预处理可能通过调节肺组织iNOS和eNOS的表达，降低肺组织NO和ET-1水平，调节血管的舒缩作用，保护肺血管内皮细胞功能。

本研究结果显示，NSC23766组p-Akt/Akt和p-NF-κB p65/NF-κB p65表达低于模型组，提示NSC23766预处理可降低VILI大鼠肺组织Akt和NF-κB的磷酸化。NFκB信号通路是细胞内最重要的调控炎性因子的信号通路，在VILI发生发展中具有重要作用[3]。文献报道，在生理状况下NF-кB与IκB结合处于被抑制状态，一旦发生磷酸化被激活，可释放NF-κB/p65进入胞核与靶序列结合，促进下游TNF-α等炎性细胞因子的表达，加重组织损伤[16]。Lu 等[17]报道，NSC23766可以抑制Akt的磷酸化抑制NF-кB信号通路，参与调节机体的炎症反应，提示NSC23766可能通过抑制Akt的磷酸化抑制NF-кB信号通路，降低VILI大鼠的炎症反应。Sara等[18]报道，甘草查尔酮C可以抑制NF-κB/iNOS/NO信号通路，保护脂多糖诱导H9c2细胞损伤，提示NSC23766预处理可能通过抑制Akt/NF-κB信号通路，调节iNOS和eNOS的表达，降低炎性因子水平，保护肺血管内皮细胞功能，减轻肺组织损伤。

综上所述，NSC23766预处理可能通过抑制VILI大鼠Akt/NF-κB信号通路，调节其肺组织中iNOS和eNOS的表达，降低肺组织炎性因子、NO和ET-1水平，保护肺血管内皮细胞结构和功能，减轻肺组织损伤，有望应用于临床VILI的预防和治疗。