利舒康胶囊对模拟高原缺氧大鼠肺组织损伤的保护作用

孟盼盼，郭建魁，王 荣，崔冰冰，景临林，马慧萍

高原低压性缺氧环境除了对人体的各组织器官系统功能、代谢等产生影响外，还会引起以缺氧为突出表现的特殊类型疾病即急性高原病[1]。当人们急进高原时，随着海拔的上升，呼吸系统首先受到缺氧的影响，肺泡上皮和毛细血管内皮细胞的各种直接和间接损伤引起机体肺损伤，最严重的急性肺损伤形式是呼吸窘迫综合征，这是急性肺损伤危重患者发病率和病死率高的主要原因，也是引起高原肺水肿的直接原因[2-4]。但现有药物还不能满足有效预防和治疗高原缺氧的需求，寻找有效的高原抗缺氧药物具有重要意义。

藏药利舒康胶囊是国家最早批准临床使用的传统中药复方制剂，具有明显的缓解高原反应、高原红细胞增多症、高原脑水肿、高原心脏病等作用[5]。课题组前期研究表明，利舒康胶囊对高原缺氧大鼠心、脑组织具有明显的保护作用[6-7]，但在对肺组织保护作用方面的研究还尚未见报道。本研究拟通过模拟高原海拔8000 m缺氧12 h观察利舒康胶囊对缺氧大鼠肺损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠(体重180～220 g)，购自兰州大学，实验动物合格证号SCXK(甘)2013-0002，饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院动物实验科。

1.2实验仪器 FLYDWC50-ⅡA型低压低氧动物实验舱(中航工业贵州风雷航空军械有限责任公司)；BP210S电子天平(荷兰赛多利斯有限公司)。

1.3药品与试剂 利舒康胶囊(青海益欣药业有限责任公司，批号：20161207)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒(批号：20161220)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒(批号:20161209)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20161220)、乳酸(LD)试剂盒(批号：20170106)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(批号：20161219)、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(批号：20161219)、过氧化氢(H2O2)试剂盒(批号：20161219)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(批号：20161220)、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶试剂盒(批号：20170106)均购于南京建成生物工程研究所。

1.4模拟海拔8000 m高原急性缺氧实验 取SPF级健康雄性Wistar大鼠72只，适应饲养3 d后随机分为常氧对照组、缺氧模型组、红景天胶囊组、利舒康胶囊低、中、高剂量组，每组12只。常氧对照组和缺氧模型组灌服等体积注射用水，红景天胶囊组灌服红景天胶囊280 mg/kg，利舒康胶囊低、中、高剂量组分别灌服280、420、560 mg/kg利舒康胶囊，灌胃给药7 d。第7天给药50 min后将动物放入低压低氧动物实验舱模拟海拔8000 m缺氧环境，以10 m/s的速度减压上升至8000 m海拔，维持缺氧12 h，完成减压缺氧后在海拔3500 m处将大鼠处死，并对肺组织进行相应处理。常氧对照组大鼠不缺氧。

1.5观察指标

1.5.1病理组织检测：各组随机取2只大鼠肺组织标本，置10%甲醛中固定，样品送往中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院病理科，进行石蜡包埋、组织切片、HE染色以及光镜观察。

1.5.2生化指标检测：各组取10只大鼠的肺组织标本，称重后加入9倍体积的生理盐水，使用组织匀浆器在冰水浴中匀浆，部分匀浆在4℃离心机内1500 r/min离心10 min，吸取上清液-80℃冻存，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶测定备用；其余匀浆在4℃离心机内3500 r/min离心10 min，吸取上清液-80℃冻存，用于GSH-PX、GSH、NOS、MDA、LD、LDH、H2O2指标测定。测定方法严格按照说明书进行。

2 结果

2.1肺组织显微结构 常氧对照组肺内支气管为单层纤毛柱状上皮结构、肺泡腔呈空泡状薄壁结构；缺氧模型组炎性细胞浸润支气管平滑肌层，肺泡壁增厚，肺泡腔缩小；红景天胶囊组肺泡壁可见明显水肿，肺泡腔缩小；利舒康胶囊低剂量组炎性细胞浸润支气管平滑肌层，部分肺泡壁增厚，肺泡腔缩小；利舒康胶囊中剂量组部分肺泡壁可见水肿；利舒康胶囊高剂量组大部分肺泡形态较好，少部分肺泡壁增厚。见图1。

2.2肺组织氧化应激相关生化指标 与常氧对照组比较，缺氧模型组大鼠肺组织MDA、H2O2含量和NOS活力均显著升高，GSH含量和GSH-PX、CAT活力显著降低(P<0.05，P<0.01)。红景天胶囊组MDA、H2O2含量、GSH-PX、CAT活力与缺氧模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，NOS活力低于缺氧模型组，GSH含量高于缺氧模型组(P<0.05，P<0.01)。利舒康胶囊中剂量组CAT活力高于缺氧模型组，利舒康胶囊高剂量组MDA、H2O2含量和NOS活力低于缺氧模型组，GSH含量和GSH-PX、CAT活力高于缺氧模型组(P<0.05，P<0.01)。见表1。

图1 模拟高原缺氧大鼠肺组织显微结构的变化(HE×400)

A.常氧对照组;B.缺氧模型组;C.红景天胶囊组;D.利舒康胶囊低剂量组;E.利舒康胶囊中剂量组;F.利舒康胶囊高剂量组

表1 6组大鼠氧化应激指标水平比较

注：红景天胶囊组给予红景天胶囊280 mg/kg灌胃，利舒康低、中、高剂量组分别给予利舒康胶囊280、420、560 mg/kg灌胃；MDA为丙二醛，H2O2为过氧化氢，GSH为谷胱甘肽，CAT为过氧化氢酶，NOS为一氧化氮合酶，GSH-PX为谷胱甘肽过氧化物酶；与常氧对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与缺氧模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

2.3肺组织能量代谢相关生化指标 与常氧对照组相比，缺氧模型组大鼠肺组织LD、LDH含量显著增加，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力显著降低(P<0.05，P<0.01)。红景天胶囊组LD含量与缺氧模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，LDH活力低于缺氧模型组，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型组(P<0.05，P<0.01)。利舒康胶囊高剂量组LD、LDH含量低于缺氧模型组，Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型组(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 6组大鼠肺组织LD、LDH、Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶比较

注：红景天胶囊组给予红景天胶囊280 mg/kg灌胃，利舒康胶囊低、中、高剂量组分别给予利舒康胶囊280、420、560 mg/kg灌胃； LD为乳酸，LDH为乳酸脱氢酶；与常氧对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与缺氧模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

3 讨论

近年来，随着高原经济的发展和旅游业的日益兴旺，越来越多的人需要进入高海拔地区，从而引发急性高原病，如果救治不及时病死率很高[8-10]。肺组织对缺氧环境的感知较为敏感，机体在缺氧环境中氧自由基代谢失衡，导致肺毛细血管内皮细胞损伤，肺血管通透性增加，加重肺组织损伤，从而引发高原肺水肿[11-13]。组织病理学结果显示，模拟海拔8000 m高原缺氧环境12 h后，缺氧模型组大鼠肺组织炎性细胞浸润支气管平滑肌层，肺泡壁增厚，肺泡腔缩小；红景天胶囊组肺泡壁可见明显水肿，肺泡腔缩小；利舒康胶囊高剂量组大部分肺泡形态较好，少部分肺泡壁增厚。提示利舒康胶囊可明显改善模拟高原缺氧大鼠肺组织的损伤。

在模拟海拔8000 m高原缺氧环境12 h后，机体会发生一定的氧自由基代谢紊乱，MDA含量显著升高，MDA可反映机体自由基的代谢情况，间接地反映出机体器官的损伤程度[14]。NOS可诱导NO的生成，而NO 的过量增多导致了机体的脂质过氧化，并诱导DNA损伤[15]。本研究结果显示，缺氧模型组大鼠肺组织MDA含量和NOS活力升高，提示大鼠在模拟低压低氧条件下，机体的氧自由基代谢确实会出现紊乱，抗氧化系统被破坏，活性氧自由基在机体内大量堆积，导致机体肺组织损伤，而高剂量利舒康胶囊给药后，MDA含量和NOS活力均出现显著降低。

H2O2主要是在机体新陈代谢中物质氧化分解过程中产生的，检测这一指标，可以反映出缺氧条件下机体受损伤的程度。而机体内过量的H2O2主要靠CAT清除，CAT是机体主要的活性氧清除酶[16]。GSH-PX是机体内广泛存在的一种过氧化物分解酶，GSH是GSH-PX的底物，是GSH-PX完成其功能的基础。GSH和GSH-PX的作用都是减少自由基的产生，防止脂质过氧化及其代谢产物对机体造成的损伤[17]。本研究结果显示，缺氧模型组大鼠肺组织H2O2含量较常氧对照组显著升高，而高剂量利舒康胶囊给药后明显降低；缺氧模型组CAT活力较常氧对照组显著降低，利舒康胶囊给药后随剂量的增大逐渐升高，中、高剂量组与缺氧模型组比较差异均有统计学意义；缺氧模型组GSH含量和GSH-PX活性较常氧对照组显著降低，经高剂量利舒康胶囊给药后显著升高。提示利舒康胶囊可抑制缺氧大鼠的氧化应激反应，减轻缺氧对大鼠肺组织造成的损伤。

LD和LDH是反映机体糖无氧酵解的两个重要指标，LD既是糖无氧酵解的产物，又是糖异生的原料之一；LDH主要使乳酸脱氢生成丙酮酸，便于利用乳酸氧化功能，检测这一指标可反映机体能量代谢的情况[18]。本研究结果显示，缺氧模型组大鼠肺组织LD含量和LDH活性均较常氧对照组显著升高，而利舒康胶囊给药后，LD含量和LDH活性均明显降低，提示利舒康胶囊能维持缺氧条件下机体对能量的消耗，延长大鼠的存活时间。

ATP是机体内主要的能量功能物质，而Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是参与主动运转的离子泵的重要成分，在维持细胞内外离子交换的过程中起着重要的作用，可作为代谢紊乱和组织损伤恢复能力的重要指标[2,19]。本研究结果显示，缺氧模型组肺组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶与常氧对照组相比显著下降，而高剂量利舒康胶囊给药后，肺组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于缺氧模型组，提示利舒康胶囊能在一定程度上缓解缺氧所致的能量代谢障碍。

综上所述，利舒康胶囊可通过调节缺氧大鼠自由基代谢和能量代谢水平提高大鼠抗缺氧能力，其主要机制可能是减轻由H2O2和MDA等“毒性”物质对机体的损伤，加强糖酵解产能作用，维持机体生存所需的能量，减轻机体因能量不足而发生组织衰竭，从而进一步提高机体抗缺氧能力。