乌司他丁对脓毒症大鼠心肌损伤及肺功能的保护作用及机制研究

明 丹，李晓荣，安立娟，王 岚，王维展

脓毒症是一类感染、严重创伤、休克等引起的全身炎症反应综合征，已成为危重患者死亡的主要因素[1]。脓毒症患者病情进展过程中，会对其心、肺、肝、肠道等器官产生不同程度损伤，导致患者脏器功能障碍、病情恶化甚至死亡[2]。目前，对于脓毒症性脏器损伤的发生机制尚未完全明确，但普遍认为炎症反应与上述过程密切相关[3]。MAPK是哺乳动物体内广泛存在的信号转导通路，可促进炎性因子的合成和释放，参与脓毒症的发生发展，包括细胞外信号调节激酶(ERK)、JNK、p38等亚族[4]。乌司他丁是一种尿胰蛋白酶抑制剂，临床上常用于治疗急性组织损伤，减轻炎症损害[5]。研究发现，乌司他丁可通过干预p38 MAPK通路减轻脓毒症性心肌损伤和肺损伤[6-7]。乌司他丁对其他MAPK通路在脓毒症中的研究较少，本研究观察了乌司他丁对脓毒症大鼠心肌损伤和肺功能的保护作用，并从ERK/JNK/p38 MAPK方面探讨了其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验药物、试剂与仪器 乌司他丁注射液(广东天普生化医药股份有限公司，国药准字：H19990134，规格：10万U)。肿瘤坏死因子-α(TNF-α， KL-E683R)、白介素-6(IL-6， LS-F3364)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1，LS-F23582)、ERK( ab53277)、JNK(ab199380)、p38(ab170099)、p-ERK(ab201015)、p-JNK(ab47337)、p-p38(ab4822)兔抗蛋白及β-actin(ab8226)鼠抗蛋白均购自美国Abcam公司，稀释比均为1∶1000。ELISA试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司。小动物超声血流仪、全自动血气分析仪购自上海玉研科学仪器有限公司；X光片暗盒购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.2脓毒症动物模型的建立 采用盲肠结扎穿孔法构建脓毒症动物模型，具体方法：术前禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，于腹部正中作切口(约1 cm)，小心分离盲肠，距盲肠根部1/3处放置丝线并结扎，用注射针刺穿盲肠末端肠壁(对穿3处)，归纳肠管后逐层缝合。假手术组行开腹分离盲肠处理，但不结扎、不穿孔。术后皮下注射适量生理盐水，补充血容量；注意保温，自由进食饮水。术后6～12 h，若大鼠出现呼吸急促、寒战、高热、少尿、动作迟缓等表现时，表明脓毒症模型复制成功[8]。

1.3实验动物与分组 选取40只SD大鼠，雄性，6～8周龄，体重180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2019-0002。随机分为假手术组、模型组、乌司他丁低、高剂量组，每组10只，各组大鼠分笼饲养。乌司他丁低、高剂量组分别皮下注射乌司他丁10×104、20×104U/kg；假手术组和模型组以等量生理盐水替代，1/d，连续给药3 d。本实验中动物操作均符合动物伦理学标准。

1.4观察指标及方法

1.4.1心肌血流动力学指标：乌司他丁干预结束后，应用小动物超声血流仪，检测各组大鼠左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩末压(LVESP)、平均动脉压(MAP)、左心室最大舒张速率(-dp/dtmax)和左心室最大收缩速率(+dp/dtmax)。

1.4.2血气指标：乌司他丁干预结束后，取各组大鼠股动脉血1 ml，以全自动血气分析仪检测pH值、动脉血氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(PaCO2)。

1.4.3心肌和肺组织病理变化：乌司他丁干预结束后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，迅速取出其心肌和肺组织，冻存于液氮罐；部分组织固定于中性甲醛溶液中，经常规脱水、石蜡包埋、切片，再行苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察组织病理变化并拍照。

1.4.4血清炎性因子水平：乌司他丁干预结束后，取大鼠尾静脉血1 ml，室温下静置20 min，以2000 r/min离心10 min，取上层血清，冻存于-80℃冰箱备用；采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中TNF-α、IL-6和HMGB1的含量。

1.4.5心肌和肺组织中ERK、IκB、JNK、p38磷酸化水平：液氮罐中取出大鼠组织，加入裂解液冰上匀浆，12 000 r/min离心10 min，分离上层蛋白液，测定其蛋白浓度；配制SDS-PAGE凝胶，电泳后转至PVDF膜；浸于含5%脱脂奶粉的Tris-HCl 缓冲液中，室温下封闭2 h；加入相应兔抗、鼠抗蛋白，4℃孵育过夜；加入相应山羊抗兔/鼠多克隆荧光二抗，室温下孵育1 h；滴加ECL试剂，应用X线片暗盒显影、定影。以β-actin表达为内参，计算p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38的相对表达量。

2 结果

2.14组大鼠心肌和肺组织病理学变化 假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，肺泡结构完整，形态正常，无明显的病理改变。模型组大鼠心肌细胞出现水肿，细胞间质增宽且伴有大量炎性细胞浸润，肺泡内有大量出血和炎性浸润。与模型组大鼠相比，乌司他丁高、低剂量组大鼠的心肌细胞病变及水肿减轻，肺泡内有少量炎性浸润，且乌司他丁高剂量组心肌细胞和肺泡病变的改善效果较乌司他丁低剂量组更显著。见图1。

图1 4组大鼠光镜下心肌和肺组织病理学变化(HE×200)

乌司他丁低、高剂量组分别给予乌司他丁10×104、20×104U/kg

2.24组大鼠心肌血流动力学参数比较 4组大鼠心肌血流动力学参数比较差异均有统计学意义(P<0.01)。模型组大鼠的LVEDP、LVESP、MAP、-dp/dtmax和+dp/dtmax均出现不同程度降低(P<0.01)。与模型组比较，乌司他丁低、高剂量组大鼠的LVEDP、LVESP、MAP、-dp/dtmax和+dp/dtmax均显著上升，且乌司他丁高剂量组上述指标高于乌司他丁低剂量组(P<0.01)。见表1。

表1 4组大鼠心肌血流动力学参数的比较

注：乌司他丁低、高剂量组分别给予乌司他丁10×104、20×104U/kg；LVEDP为左心室舒张末压，LVESP为左心室收缩末压，MAP为平均动脉压，-dp/dtmax为左心室最大舒张速率，+dp/dtmax为左心室最大收缩速率；与假手术组比较，bP<0.01,与模型组比较，dP<0.01；与乌司他丁低剂量组比较，fP<0.01

2.34组大鼠动脉血气分析指标比较 4组大鼠血气指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠PaO2和pH值显著降低，PaCO2显著升高(P<0.01)；与模型组相比，乌司他丁低、高剂量组大鼠PaO2和pH值显著升高，PaCO2显著降低；且乌司他丁高剂量组上述指标变化更显著(P<0.01)。见表2。

2.44组大鼠血清炎性因子水平比较 4组大鼠血清炎性因子比较差异均有统计学意义(P<0.01)。与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均显著上升(P<0.01)。与模型组相比，乌司他丁低、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均显著下降，且乌司他丁高剂量组上述指标低于乌司他丁低剂量组(P<0.01)。见表3。

2.54组大鼠相关信号通路水平比较 与假手术组相比，模型组心肌和肺组织中ERK、JNK、p38磷酸化水平均显著上调(P<0.01)。与模型组比较，乌司他丁低、高剂量组大鼠ERK、JNK、p38磷酸化水平显著下调，且乌司他丁高剂量组低于乌司他丁低剂量组(P<0.01)。见图2。

表2 4组大鼠动脉血气分析指标比较

注：乌司他丁低、高剂量组分别给予乌司他丁10×104、20×104U/kg；PaO2为氧分压，PaCO2为二氧化碳分压；与假手术组比较，bP<0.01,与模型组比较，dP<0.01；与乌司他丁低剂量组比较，fP<0.01

3 讨论

目前认为，炎症反应是脓毒症的主要病理基础之一。近年来，虽然围绕着炎症反应不断优化脓毒症的治疗方案，但危重脓毒症患者的病死率仍居高不下，而多器官功能障碍是死亡的常见原因之一[9]。体外研究脓毒症的动物模型最常用方法有内毒素/脂多糖诱导、盲肠结扎穿孔术造模等[10]。内毒素/脂多糖模型仅仅模拟了革兰阴性菌感染性脓毒症，无法体现混合感染的特点；而盲肠结扎穿孔模型可造成混合性的革兰阴性菌及阳性菌的感染，更符合临床脓毒症特点[11]。本研究采用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症模型，术后6 h大鼠逐渐出现动作迟缓、呼吸急促、寒战、少尿、精神萎靡的症状，提示脓毒症大鼠模型复制成功。脓毒症发展过程中，常累及其他器官；本研究病理检测结果显示，脓毒症大鼠心肌细胞出现水肿，细胞间质增宽且伴有大量炎症细胞浸润，肺泡内有大量出血和炎性浸润，其病理学特征符合脓毒症多器官损伤。

表3 4组大鼠血清炎性因子水平比较

注：乌司他丁低、高剂量组分别给予乌司他丁10×104、20×104U/kg；TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-6为白介素-6，HMGB1为高迁移率族蛋白B1；与假手术组比较，bP<0.01,与模型组比较，dP<0.01；与乌司他丁低剂量组比较，fP<0.01

图2 4组大鼠心肌和肺组织中ERK、IκB、JNK、p38磷酸化水平比较

A.假手术组；B.模型组；C.乌司他丁低剂量组；D.乌司他丁高剂量组；乌司他丁低、高剂量组分别给予乌司他丁10×104、20×104U/kg；ERK为细胞外信号调节蛋白激酶

乌司他丁属于人类内源性抗炎物质，其化学结构上具有两个活性功能区，除了蛋白酶抑制作用，还具有稳定溶酶体膜、抑制心肌活性氧及多种炎性因子生成的作用；其可明显改善脓毒症大鼠的心肌损伤和肺功能[12-13]，为本研究提供了理论基础。本研究结果显示，乌司他丁高、剂量组大鼠心肌和肺组织损伤明显减轻，心肌血流动力学参数和血气指标得到明显改善，提示乌司他丁具有改善脓毒症大鼠心肌损伤和肺功能的作用，与文献报道结果相符[14-15]。脓毒症发生发展过程中涉及多种炎性因子的释放，TNF-α为脓毒症的启动炎性因子，可介导其他炎性介质放大炎症信号，产生“瀑布”级联反应，刺激单核细胞、巨噬细胞等分泌促炎因子(IL-6、IL-1β等)；还可参与体内代谢及免疫，启动凝血过程[16]。HMGB1是由单核细胞、巨噬细胞释放的炎性介质；研究发现，HMGB1是脓毒症致死效应中的关键因子，其水平可直接影响脓毒症的病情及预后[17]。本研究结果显示，与模型组相比，乌司他丁高、低剂量组血清TNF-α、IL-6、HMGB1水平均显著下降；表明乌司他丁可显著抑制炎性因子的释放，与刘赟和吴星恒等[18]研究结果相似。

为进一步阐明乌司他丁抗炎的作用机制，本研究观察了乌司他丁干预脓毒症大鼠后MAPK信号通路活性的变化。ERK、JNK、p38信号通路均可被TNF-α激活，诱发炎症级联反应，从而产生更多炎性细胞因子[19]。本研究结果显示，与模型组相比，乌司他丁低、高剂量组大鼠心肌和肺组织中ERK、JNK、p38蛋白磷酸化水平显著降低，提示乌司他丁可通过下调TNF-α的分泌，从而阻碍ERK、JNK、p38信号通路异常激活，最终对脓毒症大鼠心肌和肺组织起到保护作用。

综上所述，乌司他丁可改善脓毒症大鼠心肌损伤和肺功能，可能通过抑制炎症信号通路(ERK、JNK、p38 MAPK)起到抗炎作用；但临床上是否有同样效用，还需多中心、大样本、前瞻性随机对照研究作进一步验证，为乌司他丁应用于脓毒症治疗提供科学指导。