冷冻离心法初榨椰子油的理化分析及其对猪皮抗氧化活性的影响

李 瑞 宋晨也 唐敏敏 张建国 宋 菲 夏秋瑜

(中国热带农业科学院椰子研究所1，文昌 571339) (华中农业大学食品科学技术学院2，武汉 430030) (海南省椰子深加工工程技术研究中心3，文昌 571339)

椰子油(coconut oil，CO)富含中短碳链脂肪酸(medium chain fatty acids，MCFAs)，能被人体快速消化吸收，迅速提供能量，且不会在人体内转化或堆积成脂肪；CO还具有促进新陈代谢、抑菌、减少自由基反应等功能，被广泛应用于食品、减肥、抑菌、护肤、护发等产品中[1]。传统的椰子油生产方法是将椰肉通过日晒或者烘干的方法制成椰干，然后将椰干压榨得到毛椰子油。但椰干在晒制过程中易引起微生物增殖，受黄曲霉毒素污染，并且所得毛椰子油的水分和游离脂肪酸含量高，品质较差，必须经过精炼后才能食用；但在精炼过程中，需要经过204～245 ℃的高温处理，椰子油的活性成分和椰香味都会发生劣变[2]。

初榨椰子油(virgin coconut oil，VCO)是采用机械或天然的方法、不经过化学方法精炼而从新鲜、成熟椰肉中制备的一种椰子油。由于其保留了椰子油中绝大多数的天然活性物质，比精炼椰子油具有更多有益于健康的功能活性，因此近十年来在国内越来越流行[3]。VCO的加工方法有很多，包括酶法[4, 5]、离心法[6]、发酵(离心)-加热法[3]和干法等。目前，已有天然椰子油面市[7]，使得海南VCO产业迅速发展，先后有30多个VCO品牌推向市场。然而，目前国内还没有颁布VCO行业或地方标准，国内厂商大多采用质量要求相对宽泛的普通椰子油的行业标准；另外由于椰子加工原料日益短缺，在VCO的生产过程中，难免存在原料新鲜度控制不严和产品质量把控不严的现象，严重影响了VCO的产业发展。

本研究以海南新鲜成熟椰肉为原料，采用能最大程度保留VCO中的活性成分、尽可能减少椰子油品质劣变的冷冻-解冻-离心法制备VCO，分析其质量指标、挥发性成分以及微量活性成分，并通过研究不同浓度VCO对猪皮的氧化稳定性指标的影响来分析VCO在护肤品中的开发前景，为高附加值VCO产品的开发与应用及其在精细化工行业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成熟椰子果、新鲜猪皮：市售。所用试剂均为分析纯，水为双蒸水。

HP5890气相色谱仪；HP6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪；UVline 9400型紫外可见分光光度计；US-32R冷冻高速离心机。

1.2 VCO的制备

1.2.1 冷冻-解冻-离心工艺

将成熟椰子果去椰衣、剥椰壳、削种皮得到白椰肉，再将白椰肉清洗、切块、榨汁得到椰浆。然后将椰浆在-60 ℃冷冻，待完全冷冻后，在65 ℃水浴中解冻；重复冷冻—解冻1次；然后将解冻分层后的椰浆在11 000 r/min离心30 min，即可得到清澈的VCO。

1.2.2 市售干法工艺

将新鲜白椰肉粉碎后薄层干燥得到新鲜椰蓉，将椰蓉用榨油机压榨得到粗椰油，然后将粗椰油过滤、澄清和干燥后得到成品椰子油。

1.3 椰浆脂肪含量测定

采用酸水解法测定椰浆脂肪含量，具体操作步骤为：准确称量10.0 g椰浆，置于50 mL具塞试管中，加10 mL浓盐酸。然后将试管放入70～80 ℃水浴中，每隔5～10 min用玻璃棒搅拌1次，至椰浆脂肪游离消化完全为止。取出试管，加入10 mL乙醇，混合，冷却后将混合物移入100 mL具塞量筒中，用25 mL乙醚分次洗试管，洗液一并倒入量筒中，加塞振摇1 min，小心开塞放出气体，再塞好，静置12 min；小心开塞，用石油醚-乙醚等混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪，静置10～20 min，待上部液体澄清，吸出上清液于已恒重的锥形瓶内，再加5 mL乙醚等量混合液于具塞量筒内，振摇，静置后，仍将上层乙醚吸出，放入锥形瓶内，将锥形瓶置于水浴锅中蒸发至干，取出擦去外壁水珠，置于(100±5) ℃烘箱中干燥2 h，取出，放入干燥器内冷却0.5 h后称重，重复操作至恒重。

1.4 VCO质量指标的测定

VCO碘值的测定参考GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》[8]，水分含量的测定参考GB 5009.236—2016《动植物油脂水分及挥发物的测定》[9]，酸价和过氧化值的测定参考GB 5009.229—2016《食用安全国家标准食品中酸价的测定》[10]。

1.5 GC-MS测定VCO中挥发性成分

采用GC-MS测定，GC条件为：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温80～260 ℃，程序升温5 ℃/min，柱流量为1.0 mL/min，进样口温度250 ℃，柱前压100 kPa，进样量0.05L，分流比10∶1，载气为高纯氦气。MS条件：电离方式EI，电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量范围35～450。采用wiley7n.l标准谱库，计算机检索定性。

1.6 GC-MS测定VCO中植物甾醇的方法

取2.0 g样品，加正己烷溶解并定容至10 mL，采用GC-MS法测定。GC条件：AB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温100～280 ℃,程序升温15 ℃/min，进样口温度280 ℃，柱流量1.2 mL/min，进样量0.2 μL，离子源温度230 ℃,连接线温度280 ℃，扫描范围29～550 u。

1.7 HPLC测定VCO中VE的方法

取VCO 1.0 g，按照GB/T 5009.82—2003皂化处理后定容至10 mL。采用HPLC测定，色谱条件：Ultimate-C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流动相为甲醇，流速1 mL/min，检测波长215 nm，进样量20 μL。

1.8 总酚酸的提取与测定

VCO中总酚酸的提取参照文献报道的方法[11]，即将10 g油脂溶解于50 mL正己烷中，使用20 mL 60%的甲醇提取3次，合并3次的萃取液并进行真空干燥，然后将干燥物溶解于已知体积的甲醇中，总多酚的含量可以用福林酚试剂法进行测定。按照福林酚试剂法测定VCO中总酚酸的含量并以没食子酸当量计算[12]。具体来说，100 μL测试样品与2.0 mL 2%的Na2CO3混合，在室温下保温2 min，然后添加100 μL 50%的福林酚试剂，在室温下反应30 min，最后在720 nm下测定吸光值。

1.9 VCO对猪皮抗氧化活性的测定

1.9.1 不同添加量的VCO对猪皮中SOD活力的影响

以黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，按照SOD试剂盒(酶标法)说明书进行，单位用U/mg prot表示。

1.9.2 不同添加量的VCO对猪皮中GSH-PX活力的影响

参照GSH-PX试剂盒说明书方法测定，单位用U/mg prot表示。

1.9.3 不同添加量的VCO对猪皮中蛋白质羰基含量的影响

根据Levine等[13]的方法，称取一定量的未经热烫的新鲜猪皮，用一定量的预冷0.9%的生理盐水漂洗后，称重，量筒量取猪皮9倍质量预冷的生理盐水后，用组织匀浆机匀浆，离心，取上清液备用。室温下，取一定量上清液，加入10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH)和2 mol/L的盐酸溶液，将该体系避光反应1 h，并每隔10 min涡旋振荡1次，再用20%三氯乙酸(TCA)溶液终止反应。反应得到的沉淀用1∶1的乙醇和乙酸乙酯混合液洗涤3次，然后将沉淀用6 mol/L的盐酸胍溶液溶解，在37 ℃下水浴保温15 min。取出在12 000 g条件下离心15 min，取上清液，在370 nm下测定上清液的吸光值，每组均与等量的2 mol/L的盐酸溶液代替DNPH溶液作为空白。

1.10 数据分析

实验数据采用Excel和SPSS13.0软件处理，组间比较采用单因素方差分析，数据间的差异性在P<0.05水平进行比较。每次实验至少测定3次。

2 结果与讨论

2.1 冷冻-解冻-离心处理从椰浆中制备椰子油的物料分析

1 000 g椰浆经冷冻-解冻-离心处理后，由于冰晶的破乳作用，椰浆原有的稳定乳化体系受到破坏，从上到下依次分为4 层：油层、油与蛋白质结合的乳化层、富含可溶性碳水化合物的乳清层及沉淀层。将各层分离并称重，将油与蛋白结合的乳化层再将冷冻-解冻-离心过程处理2次，将各层分离并称重，合并3次处理所得油层、乳化层、乳清层和沉淀层的质量(表1)。由表1可见，经3次冷冻-解冻-离心后，共提油205.3 g，经测定椰浆含油量为42.8%，所以以椰浆含油量计算实际得油率为48.0%。

椰浆的副产物包括乳清层和沉淀层，乳清层的主要成分包括水分、可溶性糖和可溶性蛋白。经过3次冷冻-解冻-离心处理后，所得乳清层质量为743.3 g，占椰浆质量的74.3%；沉淀层主要是不溶性的椰子蛋白，经计算，3次处理后所得椰蛋白共为20.79 g，占椰浆质量的2.1%；经过3次处理后，乳清层的pH没有显著变化(表1)，说明椰浆新鲜度非常好，这也是由于在整个处理过程中，体系温度都在60 ℃以下的温度范围内；副产物乳清可用作可溶性蛋白提取以及椰子蛋白饮料和椰纤果等的制作原料。

表1 冷冻-解冻-离心工艺物料衡算

2.2 VCO的质量指标

水分含量、酸价和过氧化值等指标可以作为衡量油脂酸败的定性和定量参考指标。随着含水量的增加，VCO的酸价显著上升；当含水量>0.10%时，酸价显著增加；当初榨椰子油的含水量≤0.10%时，其酸价变化比较小，此时的VCO是非常稳定的[14]。Villarino等[3]对发酵-加热法、离心-加热法制备的VCO进行了描述性感官评定，VCO被描述为近乎无色、具有轻微的酸味和可察觉的坚果香气，其中发酵-加热法制备的VCO具有脂肪酸酸败气味。若油脂中含有过量的水分，会促使油脂水解而产生游离脂肪酸，加速油脂酸败；这可能是由于未加热的VCO样品中含有的微生物把油脂降解为甲基酮，另一个可能的解释是VCO中含有的水分加剧了C8-C12游离脂肪酸的释放，这些脂肪酸同时会被部分降解为甲基酮，而甲基酮会产生不受欢迎的“香料酸败气味”。

本实验采用冷冻-解冻-离心法制备的VCO在26 ℃以上为澄清透明的液体，具有纯正的椰子香气，没有可察觉的酸败味。测定其含水量、酸价、过氧化值和碘值等质量指标，这些都是决定VCO货架寿命的主要指标(表2)。碘值指的是100 g油脂或脂肪所吸收碘(I2)的质量，反映了油脂中不饱和脂肪酸的含量，即不饱和脂肪酸含量越高，碘值越大，因此可以用碘值来鉴别不同种类的植物油[15]。由于VCO中的不饱和脂肪酸为6.51%的油酸和0.74%的亚油酸[16]，其余为饱和脂肪酸，所以其碘值较低，为5.53 g/100 g油(表2)，在APCC标准范围之内。冷冻-解冻-离心法制备的VCO含水量仅为0.091%，低于APCC要求的0.10%;其酸价为0.18 mgKOH/g油，过氧化值为0.31 mmol/kg油，而干法制备的椰子油的过氧化值为2.85 mmol/kg，显著高于冷冻-解冻-离心法所制备的椰子油。可见，VCO要优于干法制备的椰子油，且质量指标远优于APCC和我国食用油国家标准的要求。由此可见，采用冷冻-解冻-离心法制备的VCO性能优越。

表2 冷冻-解冻-离心法VCO与市售VCO质量指标的比较

注：“—”表示未做检测，数据标有不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)。

2.3 VCO的挥发性成分的种类及含量

VCO所特有的椰子香气与其中的微量挥发性成分关系很大。测定植物油中的挥发性成分，有顶空法(静态顶空法、动态顶空法)、顶空吸附萃取、直接热解析和固相微萃取技术[17]。早期研究已经鉴定出一系列的碳氢化合物、甲基酮和δ-内酯等成分，这些有机物是产生椰子油香气成分的主要化合物[18, 19]。Padolina等[20]的研究表明δ-辛内酯是呈现椰子气味的关键化合物，但研究没有测定具体的挥发性成分含量。此外，提取方法对椰子油挥发性成分影响较大，董李雅等[21]测定了冷榨法、超临界、亚临界和溶剂提取法所制备椰子油的挥发性成分，主要鉴别出醇类、酸类、酮类、酯类、醛类、烃类等挥发性成分。

由表3可见，冷冻-解冻-离心法制备的VCO与干法制备的椰子油共鉴定出54种挥发性成分，其中酯类化合物12种，醇类化合物4种，烃类化合物19种，酮类化合物4种，酸类化合物3种，醛类化合物2种，其他化合物5种。此结果比董李雅等[21]报道的挥发性成分种类少，这可能是由于该方法在测定过程中采用了高温(110 ℃)热脱吸附，而椰子油在高温下有可能发生一系列氧化反应，该方法产生更多种类的挥发性成分。

表3 冷冻-解冻-离心法和干法制备椰子油中 挥发性组分及其相对质量分数/%

续表3

注：“-”表示未检测到。

Santos等[17]采用顶空固相微萃取-气质联用(SPME-GCMS)，测定了不同方法制备的VCO产品的挥发性有机成分，共测定出14种有机挥发性成分，包括乙酸乙酯、乙酸、2-戊酮、己醛、辛烷、2-庚酮、柠檬烯、壬醛、辛酸、辛酸乙酯、δ-辛内酯、硅酸乙酯、δ-癸内酯和月桂酸。而本研究冷冻-解冻-离心法所制备的椰子油含量最高的挥发性有机成分为δ-辛内酯，与Padolina等[20]报道的结果一致，其次为辛酸乙酯、δ-己内酯、柠檬烯、癸酸乙酯、δ-癸内酯、癸烷、壬烷、壬酮等。其中δ-辛内酯呈现椰子和可可等香气，柠檬烯具有新鲜橙子香气及柠檬样香气，癸酸乙酯呈椰子香味，δ-癸内酯具有椰子及桃子似的果香气；月桂酸乙酯带花生香气，也存在于冷冻-解冻-离心法所制备椰子油中[21]。与干法制备的椰子油相比，采用冷冻-解冻-离心法制备的椰子油挥发性有机成分不含游离酸、醛以及其他不良挥发性成分。乙酸、醛类与酮类物质都是水解酸败或者氧化酸败过程中产生的不受欢迎的化合物[3]，而研究制备的VCO的挥发性物质不含酸类和醛类，酮类含量也很低，这可能是由于制备的VCO没有经过加热处理，使得VCO没有可察觉的酸败气味，酸价低，品质好。

2.4 VCO中微量活性成分含量

本研究制备的VCO中总酚酸质量分数为180 mg/kg，VE含量为89.8 mg/kg，植物甾醇的含量为420 mg/kg。VCO具有防止LDL被氧化的作用，其中含有未皂化的生物活性成分如VE，VA原、多酚和植物甾醇[21]。食用富含多酚类物质的食物可能会对人体有益[22]。Dia等[23]和Marina等[24]研究结果均表明，VCO中的多酚含量显著高于精炼椰子油，因为干法生产的椰子油所经历的精炼过程极大地破坏了椰子油中的多酚；VCO的抗氧化活性也比精炼椰子油高，且多酚物质含量较高的VCO的抗氧化活性也比较高。Marina等[25]的研究表明，VCO中最主要的酚酸类物质是阿魏酸和p-香豆酸；总多酚含量分别与清除能力、还原能力、对β-胡萝卜素的漂白能力具有很高的相关性，且发酵法制备的VCO比冷冻法制备的VCO具有更强的清除二苯基苦味酰基苯肼的能力和对β-胡萝卜素亚油酸酯漂白的能力；而冷冻法得到的VCO具有较强的还原能力。

2.5 VCO对猪皮抗氧化作用研究

2.5.1 VCO对猪皮皮肤中SOD活力影响

注：不同字母表示样品间差异达到显著水平(P<0.05)，余同。
图1 VCO和蒸馏水对猪皮中SOD活力的影响

2.5.2 VCO对猪皮中GSH-PX活力的影响

GSH-PX是生物机体内重要的抗氧化酶之一，它可以消除机体内的H2O2及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂，以硒代半胱氨酸的形式发挥作用，以谷胱甘肽为还原剂分解体内的脂质过氧化物，因而可防止细胞膜和其他生物组织免受过氧化损伤[28]。在不添加任何物质时，猪皮匀浆的GSH-PX活力为5.327 U/mg prot。而由图2可知猪皮匀浆在加入不同量的蒸馏水和VCO后，加蒸馏水对照组的GSH-PX活力明显低于猪皮匀浆本身GSH-PX活力和加入VCO后GSH-PX活力，且加VCO后GSH-PX活力呈逐渐上升趋势，最高达到20.461 U/mg prot。对照组和VCO组GSH-PX活力差异显著(P<0.05)，说明VCO有显著提高猪皮GSH-PX活力的能力。

图2 VCO和蒸馏水对猪皮中GSH-PX活力的影响

2.5.3 VCO对猪皮中蛋白质羰基化的影响

蛋白质糖基化是蛋白质氧化损伤中的一种，其本身是氧化应激中的一种不可逆的化学修饰，指的是氨基酸残基侧链受到氧的攻击最后转变成羰基产物[31]。氧化应激产生的活性羰基类物质主要是一些不饱和醛，如4-羟基壬烯醛丙烯醛、丙二醛等，在生物体系中扮演着非常重要的作用，在氧化剂和自由基攻击生物体系而引起的细胞毒性过程中，活性羰基类物质便是直接的致病因子[32]。现有的研究表明，活性羰基类物质甚至参与和启动了衰老过程[33]。Yin[34]率先提出羰基应激衰老理论，认为羰基应激是生物衰老的核心生化过程之一，蛋白质羰基化与皮肤的衰老具有密切联系。因此，抑制蛋白质羰基化是皮肤抗氧化的一个重要途径。由图3可知，添加VCO组蛋白质羰基的吸光度显著小于对照组蒸馏水组的吸光度，且随着VCO添加量的增加，吸光度呈逐渐下降趋势，且对照组和VCO组数据差异显著(P<0.05)，说明VCO有显著的抗蛋白质羰基化的能力。

图3 VCO和蒸馏水对猪皮中蛋白质羰基的影响

3 结论

采用冷冻-解冻-离心法制备的VCO的各项质量指标均符合APCC的质量要求，具体来讲，VCO的水分及挥发物含量为(0.055±0.041)%；酸价为(0.074±0.021) mg KOH/g；过氧化值为(0.31±0.051) mmol/kg；碘值为(5.53±0.071) g/100 g；采用GC-MS测定的VCO的挥发性有机成分含量从高到低依次为δ-辛内酯，辛酸乙酯、δ-己内酯、柠檬烯、癸酸乙酯、δ-癸内酯、癸烷等。

VCO中总酚酸含量为18 mg/100 g，植物甾醇含量为420 mg/kg，VE含量为89.8 mg/kg。在一定条件下，不同添加量的VCO对猪皮中SOD活力、GSH-PX活力和蛋白质羰基均有影响，随着VCO量的增加，猪皮中SOD活力和GSH-PX活力逐渐增加，蛋白质羰基含量逐渐减少，相比对照组蒸馏水，VCO的作用显著。本研究表明VCO具有明显的抗氧化能力，可以作为抗氧化性护肤品的基础原料。

采用冷冻-解冻-离心法生产的VCO，工艺条件温和，耗时短，所得VCO最大程度保留了椰子油中的未皂化活性成分，椰香味纯正，可直接被用来食用、烹饪，涂抹护肤护发。近年来VCO越来越受消费者青睐，国内外市场份额不断上升，市场竞争日益激烈。各厂家在降低生产成本的同时，要保证产品质量，不断挖掘VCO的功能特性，开发高附加值的VCO功能食品和高档护肤品。