白芷HPLC指纹图谱的研究

张 烨，孙艳雪，马宇衡, 屠鹏飞，薛培凤*

（1.内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.北京中医药大学中药学院 中药现代研究中心，北京 100029）

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，为《中国药典》（2015年版一部）收载的中药材之一。白芷为传统中医临床常用药物，其药用价值较为广泛，其销量也在逐年增加，在中药材的对外交易中占重要地位，远销日本、东南亚等地。由于野生资源日益匮乏，现在的白芷主要为栽培品[1]。

白芷药用历史悠久，具有镇痛[2]、抗炎[3]、美白[4]、抗肿瘤[5]等功效。白芷化学成分较为复杂，主要为香豆素类[6]和挥发油类[7]。白芷一般按其产地分为杭白芷、川白芷、禹白芷和祁白芷。受药材植物来源、生长环境、加工方式等因素的影响，不同产地的白芷质量也会存在一定差异[8]。加之与日俱增的白芷代用品、相似品和地方白芷品种在市场上交易，因此需创建一个全面的、系统的白芷质量控制分析方法。中药指纹图谱具有全息性、客观性、准确性、整体性及模糊性的特征，能较好地表征中药化学物质组成的整体性及复杂性，全面地反映中药中的化学成分信息，被广泛运用到中药质量评价中[9]。

本文采用二元梯度洗脱模式，建立了不同产地的21批白芷药材的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。共确定了20个共有色谱峰，并将其色谱峰导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）软件，对其质量进行评价, 取得了较为满意的结果。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2030C高效液相色谱仪（包括四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，日本岛津）； BSA124S型电子分析天平（Sartorius）；KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 试药

本研究所用的21批白芷药材采集于各地药店。样品经内蒙古医科大学药学院王素巍老师鉴定，见表1。样品预处理：粉碎机粉碎，过4号筛（65目），置密封袋中，干燥、避光条件下密封保存并编号。欧前胡素对照品（批号：110826-201916），异欧前胡素对照品（批号：110827-201911），水合氧化前胡素对照品（批号：Y07M9H55367），比克白芷素对照品（批号：110826-201916），cnidilin对照品（批号：Y07M9Q45983）均购于上海源叶生物科技有限公司，质量分数均达98 %以上。甲醇（色谱纯，美国J T Baker公司）；其他试剂均为分析纯；双蒸水（自制）。

1.3 数据处理软件

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A版）对数据进行处理。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.01 %三氟乙酸水溶液；B为甲醇。实验采用二元梯度洗脱（见表2）。流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为300 nm，进样量10 μl。

表1 21批白芷样品的来源

表2 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液制备

精密称取欧前胡素对照品、异欧前胡素对照品适量，加甲醇制成每毫升含欧前胡素、异欧前胡素分别为20，10 μg的对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液制备

取白芷样品粉末（过4号筛）约1.0 g，精密称定，置50 ml具塞三角瓶中。加入甲醇25 ml，摇匀，称定，密塞，编号并记录。超声提取1 h，共提取1次。提取结束后冷却至室温。用100 %甲醇补足重量，摇匀，转移至离心管中，离心，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南》[10]，将所得的色谱图转换成AIA格式后输入相似度评价软件，通过比较图谱的相似度进行方法学考察。

2.4.1 精密度考察 按2.3项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件进样分析，连续进样6次。将所得的色谱图输入相似度评价软件进行比较。结果发现其相似度均大于0.95，且各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于0.5 %，符合指纹图谱要求。

2.4.2 重现性考察 平行制备6份供试品溶液，分别进样分析，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行比较。结果发现其相似度均大于0.95，且各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于0.5 %，说明该方法的重现性较好。

2.4.3 稳定性考察 取同一份供试品溶液，按2.1项色谱条件分别在0，2，4，8，16，24 h进样分析，将色谱图输入相似度评价软件进行比较。结果表明，其相似度均大于0.95，且各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于0.5 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5 白芷HPLC标准指纹图谱的建立及分析

取采集的21批白芷药材样品，分别按2.1项色谱条件进样分析，得到各批药材的HPLC指纹图谱。建立对照指纹图谱（见图1），并将所得色谱图输入相似度评价软件进行分析，结果见表3。

表3 21批白芷样品的相似度评价结果

图1 21批白芷样品色谱重叠峰

标准指纹图谱反映了药材化学成分的基本特征，为不同批次的药材比对提供了参考。本通过对21批次白芷样品的相似度进行比较可见，17号样品药材的指纹图谱相似度较大，表明其质量较好，较为完整地反映了白芷药材的基本特征。因此可将此样品的指纹图谱作为白芷药材的标准指纹图谱（见图2）。

图2 17号样品图谱与标准指纹图谱的比较

如图2所示，标定出20个共有峰。其中16号色谱峰满足内参照峰的2个条件：与相邻的色谱峰分离良好；为各待测样品共有色谱峰。

按2.1项色谱条件，将配制好的对照品溶液逐一进行HPLC-DAD分析，经与对照品的保留时间、紫外吸收等信息进行比较，鉴别了标准指纹图谱中的5个峰，结果见图3。

图3 白芷HPLC标准指纹图谱色谱峰的鉴别

3 讨论

3.1 供试品的制备方法考察

3.1.1 提取方法的考察 较常用的中药化学成分的提取方法有超声法、冷浸法及回流法。分别取以上3种提取方法所得的供试品溶液10 μl，进行HPLC分析。结果发现，超声提取法峰面积相对较大。超声波独特的物理特性，使中药有效成分提取更充分，提取效率更高，因此选用超声提取法。

3.1.2 提取溶剂的考察 文献多以乙醇及甲醇为提取溶剂。以乙醇及甲醇为溶剂，采用超声法提取，而后进样分析。通过HPLC计算两图谱中色谱峰的数目、峰高及峰面积得出结论，甲醇提取效率明显优于乙醇，最终选择甲醇作为提取溶剂。

3.1.3 提取条件的优化 考察甲醇浓度，溶剂体积、提取时间、提取次数对白芷提取效果的影响。结果发现，取白芷样品约1.0 g，加25 ml甲醇提取1 h，共提取1次，提取效果最佳。

3.2 色谱条件的选择与优化

3.2.1 检测波长的选择 本研究采用二极管阵列检测器（DAD）在210～400 nm波长范围内进行全波长扫描，综合比对不同波长下色谱图中色谱峰的数目、峰高及峰面积，最终确定了300 nm为最佳检测波长。

3.2.2 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水、甲醇-水-三氟乙酸、乙腈-水、乙腈-水-三氟乙酸4种流动相系统，其中用甲醇-水-三氟乙酸系统即能使其成分得到很好的分离。所以最终选定甲醇-三氟乙酸水作为流动相。

3.2.3 柱温的选择 本实验分别考察了25，30，35℃ 3个不同柱温对的色谱峰的影响，通过比较，最终确定了柱温为30 ℃时，各色谱峰的分离效果较好。

4 结论

本文选取了21批白芷样品创建共有模式，较好地保证了共用模式创建的全面性、代表性和科学性。全国各地收集的21批白芷药材相似度介于0.732～0.968之间，说明所收集样品具有一定的代表性，与此同时反应了市场上流通的白芷质量良莠不齐，须加以区分。相似度在0.9以上的有19批，另外两批相似度分别为0.732，0.783。由指纹图谱可见，这两批药材12、13号峰的相对峰面积较大，相应化学成分相对含量较高。结合紫外吸收特征，得出这两种成分均为香豆素类。这两个相对含量较高的化学成分是否为药效成分，尚需进一步研究。