气相色谱法测定替比培南酯中的残留溶剂

李 龙，颜世强，郭 伟*，郑德强

（1.山东达因海洋生物制药有限公司，山东 威海 264300；2.山东省药学科学院，山东 济南 250101 ）

替比培南酯是替比培南的前体药物，口服后被酯酶水解释放出母核替比培南，与细菌青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制细胞壁的合成，是可口服的碳青霉烯类抗生素。2009年首次在日本上市，本品具有广谱抗菌性、活性强、副作用小等优点，临床上用于治疗儿童上呼吸道与耳鼻喉感染的治疗[1-3]。

本品在合成过程中使用到乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚、N,N-二甲基甲酰胺等有机溶剂，根据2015年版中国药典规定，对于合成所使用的有机溶剂应建立合理的检测方法对残留溶剂进行监控，并且其含量不得大于规定限度[4]。本文采用毛细管柱的气相色谱法，以顶空方法进样，测定替比培南酯中残留溶剂。进行了精密度、回收率等方法学验证，结果表明本法简单、快捷、灵敏、可靠。

1 仪器和试剂

1.1 仪器

安捷伦7890A型气相色谱仪，7697E型顶空进样器，DB-624毛细管色谱柱（30 m×0.53 mm，3.0µm，安捷伦科技有限公司）。

1.2 试剂

替比培南酯（由本单位自制，批号：20130301，20130302，20130303）；乙腈（TEDIA，批号：16125072，含量：99.7 %）；无水乙醇（康科德，批号：160722，含量：99.9 %）；甲基叔丁基醚（TEDIA，批号：12110633，含量：99.0 %）；N,N-二甲基甲酰胺（科密欧，批号：20060701，含量：99.0 %）；乙酸乙酯，正丁醇，异丙醇（国药集团，批号：20150916，T20100517，20151204，含量分别为99.5 %，99.5 %，99.0 %）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液1制备 精密称取乙腈8.6 mg，无水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚各约100 mg，置入同一50 ml量瓶，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液3 ml，置入25 ml量瓶，加N,N-二甲基乙酰胺稀释至刻度，摇匀，精密量取2.0 ml，置入顶空瓶，密封，即得。

2.1.2 对照品溶液2制备 精密称取N,N-二甲基甲酰胺11 mg，置入已加入二甲基亚砜约40 ml的50 ml量瓶，再加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取2 ml，置入10 ml量瓶，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，精密量取2 ml，置入10 ml顶空瓶，密封，即得。

2.1.3 供试品溶液1制备 精密称取本品约100 mg，置入顶空瓶，精密加入N,N-二甲基乙酰胺2.0 ml，振摇使溶解，密封，即得。

2.1.4 供试品溶液2制备 精密称取本品约0.5 g，置入10 ml量瓶，加入二甲基亚砜溶解并定稀释刻度，精密量取2 ml，置入顶空瓶中，密封，即得。

2.2 色谱条件

2.2.1 乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚测定色谱条件 色谱柱为6 %氰丙基苯基-94 %二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（DB-624，30 m×0.53 mm，3.0 µm）；柱温为起始温度40 ℃，以5 ℃/min速率升温至70 ℃，再以30 ℃/min速率升温至220 ℃，保持2 min；进样口温度200℃；检测器温度为250 ℃；载气为氮气，流速为2 ml/min。顶空瓶平衡温度为90 ℃，平衡时间为30 min，进样体积为1.0 ml。

2.2.2N,N-二甲基甲酰胺测定的色谱条件 色谱柱为6 %氰丙基苯基-94 %二甲基聚硅氧烷为固定液的毛细管柱（DB-624，30 m×0.53 mm，3.0 µm）；柱温为程序升温，起始温度100 ℃，以15 ℃/min速率升温至230 ℃，保持3 min；进样口温度220 ℃；检测器温度为250 ℃；载气为氮气，流速为2 ml/min。顶空瓶平衡温度为110 ℃，平衡时间为20 min，进样体积为1.0 ml。

3 结果与讨论

3.1 顶空平衡温度的选择

本实验首先使用同一色谱条件检测乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚、N,N-二甲基甲酰胺，顶空平衡温度90 ℃，但N,N-二甲基甲酰胺在此平衡温度下，难以挥发至检出浓度。因此采用平衡温度110 ℃单独检测N,N-二甲基甲酰胺[5-6]。

3.2 柱温选择

3.2.1 乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚 选取乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚对照品溶液，按表1对色谱柱柱温进行筛选，通过考察对照品的最小分离度，最终确定了选取色谱条件3作为乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚最终测定条件。

表1 升温程序对最小分离度影响

3.2.2N,N-二甲基甲酰胺 由于N,N-二甲基甲酰胺响应较低[7-8]，通过改变顶空平衡温度与顶空瓶体积，以期提高其响应值，最终确定了条件4作为测定条件。

表2 顶空条件对N, N-二甲基甲酰胺峰面积影响

3.3 方法学验证[9]

3.3.1 线性 分别取乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、甲基叔丁基醚和N,N-二甲基甲酰胺对照品储备液，配制浓度为6.85～34.24 µg/ml，0.083～0.416，0.083～0.415，0.083～0.415，0.083～0.416，0.084～0.420 mg/ml和1.089～10.89 µg/ml的对照品溶液，按2.2项色谱条件检测，各组分的线性回归方程及相关系数见表3。

表3 线性回归方程及相关系数

3.3.2 精密度 按照分析步骤平行测定6份样品，记录峰面积（A）与保留时间（RT），计算RSD，结果见表4。

表4 残留溶剂系统精密度试验结果

3.3.3 回收率 按2.1.1项方法制备对照品贮备液，精密量取对照品贮备液2.4，3.0，3.6 ml，用N,N-二甲基乙酰胺分别稀释成25 ml溶液，称取替比培南酯约100 mg，共9份，置10 ml顶空瓶中，分别加入上述对照品溶液2 ml，密封，作为回收率供试品溶液1，依法测定。按2.1.2项方法制备对照品贮备液，精密称取替比培南酯约0.5 g，共9份，置入10 ml量瓶，分别加入上述溶液1.6，2.0，2.4 ml，各3份，加入二甲基亚砜溶解并定容至刻度，摇匀，作为回收率供试品溶液2，精密量取回收率供试品溶液2各2 ml置入10 ml顶空瓶，依法测定，结果见表5。

3.3.4 检测限 量取对照品贮备液，进行适当稀释，使各成分产生约3倍基线噪音的信号。乙醇、异丙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正丁醇和N,N-二甲基甲酰胺的最低检测浓度分别为0.84，0.83，0.173，0.083，0.167，2.084和1.089 μg/ml。

表5 回收率试验结果

3.4 样品分析

按上述方法对多批样品中残留溶剂进行检测，采用外标法进行定量，结果见表6。

表6 有机残留溶剂测定结果