系统性红斑狼疮患者外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞水平变化的临床意义

王锡携

(东方市东方医院检验科，海南 东方572600)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是好发于青壮年的免疫性疾病，发病高峰年龄为27～29岁，统计显示我国患病率约70～100/10万人，且以每年1.6～10万的速度增加，男女患者比例约1∶10[1]。SLE发病机制尚未完全清楚，目前普遍认为是由机体免疫功能紊乱所致，常见包括自身抗体形成、补体激活及淋巴细胞浸润等，其中遗传、环境及性激素水平异常等因素均可能参与SLE发病和进展[2-3]。固有免疫细胞无需抗原诱导即可识别和杀灭部分异常细胞，其中自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)为重要组成部分，有研究表明NK细胞表面CD16+占比为90%，CD56+占比超过95%，而CD3通常表现为阴性，近年来在SLE中的影响逐渐引起关注[4-5]。SLE随病情进展可累及皮肤、关节及血液等多个器官系统，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)为SLE常见并发症和致死原因，Lin等[6]报道显示NK细胞介导的免疫异常包括淋巴细胞异常活化，免疫复合物损伤及免疫耐受丧失等多个层面，可能在SLE和LN发病中占有重要地位。本研究主要对SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞水平进行检测并分析其变化规律，为明确其在SLE发病和进展中的作用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年8月至2019年8月本院SLE患者94例为研究对象，其中男性15例，女性79例，年龄20～67岁，平均(32.46±5.28)岁，病程2～51个月，平均(13.82±4.05)个月，根据SLE疾病活动性指数(SLEDAI)[7]评分将患者分为活动组38例(≥5分)和非活动组56例(<5分)。纳入标准：①符合SLE相关诊断标准[8]；②年龄≥18岁；③此前6个月内未接受免疫调节治疗；④患者及家属知情并同意本研究。排除标准：①合并风湿性病变；②伴其它免疫性疾病；③伴活动性消化道疾病；④妊娠期或哺乳期患者；⑤伴精神状态异常。另选取本院同期健康体检者50例为对照组，其中男性7例，女性43例，年龄18～65岁，平均(34.09±5.61)岁，两组年龄和性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 研究方法

患者入院后收集性别、年龄和病程等基本资料，同时进行血常规、尿常规及肝肾功能等常规检查，采用SLEDAI对病情进行评估和分级，另采集两组外周静脉血3 mL于EDTA-K3抗凝管中，摇匀后室温保存并采用FACS Aria II流式细胞仪(美国BD公司)及配套试剂检测CD3-CD16+CD56+NK细胞数量和比例。具体方法如下：取50 μL全血标本置于BD Trucount绝对计数管并分别标记为A管和B管，调整细胞数量为1×107/mL，然后于A管中加入CD3-FITC、CD45-PerCP、CD4-APC及CD8-PE各20 mL，B管中加入CD3FITC、CD(16+56)-PE、CD45-PerCP级CD19-APC各20 mL，分别混匀后在20～25 ℃环境下避光反应15 min，向两管分别加入BD Multitest IMK kit溶血素(1×)450 μL，充分摇匀后同上述条件孵育15 min，完成后将样本上机检测并采用Cellquest软件获取和分析数据，测量其中CD3-CD16+CD56+NK细胞计数和百分率。

1.3 观察指标

根据肾功能检测结果判断肾脏受累情况，将患者分为狼疮性肾炎(LN)组和非LN组，比较SLE组和对照组、活动组和非活动组及LN组和非LN组CD3-CD16+CD56+NK细胞表达差异，并分析CD3-CD16+CD56+NK细胞百分率与SLE患者SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量的相关性，探讨CD3-CD16+CD56+NK细胞百分率评估SLE活动性和LN的准确性。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 SLE组和对照组CD3-CD16+CD56+NK细胞表达比较

SLE组CD3-CD16+CD56+NK细胞计数和百分率明显低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 SLE组和对照组CD3-CD16+CD56+NK细胞表达比较

2.2 活动组和非活动组检查结果比较

活动组CD3-CD16+CD56+NK细胞计数和百分率低于非活动组，SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量高于非活动组(P<0.05)。见表2。

表2 活动组和非活动组检查结果比较

2.3 LN组和非LN组检查结果比较

LN组CD3-CD16+CD56+NK细胞计数和百分率低于非LN组，SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量高于非LN组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 LN组和非LN组检查结果比较

2.4 CD3-CD16+CD56+NK细胞与SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量的相关性

Pearson积差分析显示，CD3-CD16+CD56+NK细胞计数与SLEDAI评分呈明显负相关性(r=-0.251，P=0.015)，与24 h尿蛋白定量呈明显负相关性(r=-0.253，P=0.014)。见图1。

图1 CD3-CD16+CD56+NK细胞与SLEDAI评分和24 h尿蛋白定量的相关性

2.5 CD3-CD16+CD56+NK细胞计数对SLE活动性和LN的评估价值

以8.04%为临界值，CD3-CD16+CD56+NK细胞计数判断SLE活动性的灵敏度为57.78%，特异度为78.57%，AUC为0.677(95%CI：0.572～0.770)；以8.84为临界值，CD3-CD16+CD56+NK细胞计数判断SLE患者发生LN的灵敏度为82.76%，特异度为72.31%，AUC为0.834(95%CI：0.743～0.903)。见图2。

图2 CD3-CD16+CD56+NK判断SLE活动性(左)和LN(右)的ROC曲线

3 讨 论

SLE患者免疫调节紊乱常累及整个免疫系统，如淋巴细胞异常活化、免疫耐受丧失及补体缺陷等，随着对各种自身抗体的深入研究，T、B淋巴细胞在SLE发病中的作用现已基本阐明，其中B淋巴细胞产生的自身抗体是导致SLE的关键因素，T淋巴细胞主要发挥免疫调节功能，可刺激B细胞活化、增殖及抗体分泌，同时还参与细胞免疫[9]。近年来有文献报道[10]NK细胞与SLE发病也具有密切联系，可见多种淋巴细胞参与了SLE病程进展，观察外周血NK细胞水平变化可能有利于进一步明确SLE发病机制，同时为患者病情评估和临床诊治提供参考依据。

NK细胞主要生理功能为自然防御和免疫调节，是继T、B细胞之后的第三类淋巴细胞谱系，在外周血单个核细胞中占比5%～15%，可通过MHC-Ⅰ分子识别并清除靶细胞，大量研究表明NK细胞在感染、肿瘤及免疫性疾病中均发挥重要作用[11-12]。文献报道SLE患者外周血NK细胞绝对值和百分率均明显减少，推测其原因可能与机体大量释放干扰素并诱导NK细胞活化和凋亡有关，但具体作用机制尚未完全阐明[13]。本研究对SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞变化进行检测，结果显示其绝对计数和百分率明显低于对照组，且活动组CD3-CD16+CD56+NK细胞计数和百分率低于非活动组，分析其原因可能与NK细胞向靶器官聚集有关，并进一步导致机体对自身抗体抑制作用减弱，这与活动期SLE患者体内可检测到自身抗体和循环免疫复合物明显增加的结果相一致[14]，可见NK细胞免疫调节在SLE发病和进展中均发挥重要作用。SLEDAI评分根据患者症状体征和实验室检查结果对病情进行客观判断，从而为激素和免疫抑制剂选用提供参考依据，本研究结果显示活动组SLEDAI评分高于非活动组，且外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞计数与SLEDAI评分呈明显负相关性，提示检测NK细胞表达情况也有利于SLE患者病情评估，作ROC曲线分析其判断SLE病情活动性的价值显示AUC为0.677，以8.04%为临界值时其灵敏度为57.78%，特异度为78.57%，表明检测外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞对评估SLE病情活动度具有一定参考价值，但单独应用时准确率仍相对偏低，同时活动组24h尿蛋白定量明显高于非活动组，提示活动期SLE患者肾脏损害更为严重。

SLE随着病情进展可造成多器官结构和功能受损，其中LN是临床最常见的并发症之一，其发病原因可能与免疫复合物在肾小球滤过膜沉积和干扰素等细胞因子表达水平升高有关[15-16]。文献报道SLE患者肾功能受损程度与淋巴细胞浸润关系密切，CD3-CD16+CD56+NK细胞在激活后可释放大量干扰素和细胞毒颗粒，并可造成肾功能损害[17]。本研究结果显示LN组CD3-CD16+CD56+NK细胞计数和百分率均明显低于非LN组，SLEDAI评分和24h尿蛋白定量明显高于非LN组，采用Pearson积差分析显示CD3-CD16+CD56+NK细胞计数与24h尿蛋白定量具有明显负相关性，表明随着NK细胞表达减少，SLE患者肾功能损害明显加重，Muskardin等[18]研究发现在MRL/lpr狼疮样小鼠肾脏存在大量NK细胞活化和干扰素等细胞因子释放并造成肾脏组织损伤，且随着病情严重程度增加，NK细胞绝对计数明显减少，推测其原因与细胞因子诱导NK细胞凋亡有关。本研究作ROC曲线分析CD3-CD16+CD56+NK细胞计数对LN诊断价值显示其AUC高达0.834，以8.84为临界值时灵敏度为82.76%，特异度为72.31%，可见检测外周血NK细胞对判断SLE患者肾功能损害具有较高参考价值。本研究不足之处仅观察了SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞变化，但NK细胞在适应性免疫调节中也占有重要地位，且SLE发病与多种免疫功能异常有关，因此后续还需要对NK细胞于T、B淋巴细胞，自身抗体以及细胞因子等的关系进行深入研究，以进一步明确NK细胞在SLE病程中的作用。

综上所述，SLE患者外周血CD3-CD16+CD56+NK细胞表达明显减少，观察其表达水平变化可为判断病情活动度和肾功能损害提供参考依据。