陆良莴苣类蔬菜斑萎病的侵染循环及其发生流行特点

张仲凯，马秀英，吴 阔，郑宽瑜，裴卫华，陈永对，王田田，吴少政

(1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/农业农村部西南作物基因资源与种质创制重点实验室，云南 昆明 650223；2.陆良县大莫古镇农业综合服务中心，云南 陆良 655607)

【研究意义】云南省陆良县地处滇中偏东，坝区平均海拔1900 m左右，在云南属于冷凉气候类型，高原夏秋蔬菜已发展成为农民增收的重点产业，至2018年底，全县大棚蔬菜基地0.55万hm2，露地蔬菜基地0.67万hm2。意大利生菜是陆良县夏秋蔬菜的大宗产品之一，莴苣类蔬菜种植面积较大的还有油麦菜，莴笋种植面积较少。是农业农村部“云贵高原夏秋淡季蔬菜基地重点县”、“设施蔬菜生产重点县”，至2018年底全县蔬菜产业综合产值120亿元，其中种植业产值16.77亿元，是农民收入的主要来源，2019年被列入云南省“绿色食品牌”创建示范县。莴苣类是陆良县蔬菜的大宗产品，近年来斑萎病发生危害严重，引起质量下降、产量损失以及农药残留超标等问题突出。明确莴苣类斑萎病的流行病学，对开展绿色防控、提升产量与品质、创建绿色食品牌和保障农民增收具有重要意义。【前人研究进展】莴苣类蔬菜包括莴笋、生菜、油麦菜等，在全球范围内广泛分布，在云南高原夏秋蔬菜中占有重要的比重。病毒病是莴苣类的主要病害，其中花叶病、花叶黄化病、坏死曲叶病、斑萎病等发生普遍。全球报道侵染莴苣类蔬菜的病毒多达10余种[1-6]，中国报道的侵染莴苣类蔬菜的病毒主要有莴苣花叶病毒(Lettucemosaicvirus，LMV)，黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV),蒲公英黄色花叶病毒(Dandelionyellowmosaicvirus，DYMV)[7]，烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)，马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)[8],番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltorthotospovirus，TSWV)[9]。在之前的研究中发现，TSWV引起的斑萎病是云南莴苣类蔬菜的主要病害，发病率在10 % ～ 90 %，个别田块引起绝产[9]，但是侵染陆良莴苣类蔬菜的病毒尚未检测鉴定。目前，国内外尚未对莴苣类病毒病的流行病学开展研究，制约对该类病害有针对性的绿色防控技术的制定和实施。【本研究切入点】从田间发生流行特点、病原、中间寄主、种苗带毒率等系统研究陆良县莴苣类蔬菜斑萎病的侵染循环及其发生流行特点。【拟解决的关键问题】明确陆良莴苣类蔬菜斑萎病的初侵染源、侵染循环及其发生流行特征，为陆良及云南高原莴苣类蔬菜斑萎病的绿色防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

材料：2019年7-8月，采集陆良县莴苣类蔬菜产区意大利生菜(Lactucasativavar.ramosaHort-Italy)、莴笋(Lactucasativavar.angustanaIrish)不同发病时期的斑萎病样品，同时采集菜地周边杂草和作物表现为疑似斑萎病的鬼针草(Bidenspilosa)、辣椒(Capsicumannuum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、烤烟K326(Nicotianatobacumvar.K326)，以及苗棚中的意大利生菜种苗。其症状表现见图1。

主要试剂：酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测用植物病毒抗体见表1。电子显微镜制样试剂，参照文献[10]中的方法配制。

1.2 试验方法

1.2.1 调查采样 采用随机调查法，在生菜与莴笋不同生长时期的生产地块调查主要病害种类及其发病率，根据病害的分布、发病率及其对产量、质量的影响确定主要病害。采集无症、不同发病程度的植株样品。在菜地周围调查和采集具有与主要病害症状相似的杂草及作物植株，通过检测确定是否为引起主要病害病毒的中间寄主。针对主要品种为意大利生菜，对苗棚生产种苗进行调查和采样。

1.2.2 电子显微镜负染色、超薄切片制样与观察 参照张仲凯等[11]的方法进行。制备样品置于FEI(TaicnaiG2 Spirit)透射电子显微镜观察、拍照。根据负染色电子显微镜观察结果，初步推测与主要病害伴随的病毒可能的归属，安排ELISA检测的植物病毒抗体种类。根据超薄切片制样电子显微镜观察结果，进一步明确病毒种类及中间寄主。

表1 ELISA检测用植物病毒抗体

1.2.3 ELISA检测 根据电子显微镜负染色观察结果，在陆良莴苣类斑萎病样品中仅观察到正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)病毒(orthotospoviruses)粒体，采用云南滇中地区发生频率较高的7种orthotospoviruses抗体(表1)，参照文献[12]中的方法进行间接ELISA检测，确定具体种类、中间寄主及种苗带毒率。判断含有病毒的标准为检测样品ELISA OD值与阴性对照或PBS的OD值比值大于1.5即判断为病毒阳性样品，并将OD比值大于1.5的样品分为4个级别，比值1.5 ～ 3.0为“+”，3.0 ～ 5.0为“++”，5.0 ～ 7.0为“+++”，7.0以上为“++++”，低于1.5比值为阴性样品，以“-”表示。并根据以上调查与采样检测结果分析陆良莴苣类蔬菜斑萎病的初侵染源、侵染循环及其发生流行特点，初步确定其流行病学特征。

2 结果与分析

2.1 陆良莴苣类蔬菜的主要病害及其发生特点

经走访和实地调查，陆良莴苣类夏秋蔬菜的主要病害为斑萎病，当地菜农称为“癞病”，典型症状为叶片皱缩，黄化及密布坏死斑点，严重的致植株死亡，其它病害发生率低。斑萎病对陆良意大利生菜的产量和质量影响较大，不同地块发病率在15 %～36 %，发病初期的植株叶片表现为褪绿，中期为黄化和部分坏死，后期为矮化、皱缩直至植株死亡(图1-a～c)。油麦菜斑萎病发病率大部分低于1 %，对产量和质量影响较小。莴笋斑萎病的发病率大部分达到90 % ～ 100 %，但因种植面积小而影响不大。

a: 意大利生菜斑萎病早期症状；b: 意大利生菜斑萎病中期症状；c: 意大利生菜斑萎病晚期症状；d：斑萎病引起的意大利生菜显著减产(缺塘为枯死植株拔除)；e：莴笋斑萎病发病地块；f：莴笋斑萎病典型病株

意大利生菜从移栽到收获平均为28 d，因种植户、种苗来源不同，斑萎病的发生有较大差异。从移栽至还苗，症状表现不明显。还苗期后，发病程度差异较大。同一地块不同发病时期并存，表明病害在田间表现为多次传播。移栽后20 d开始发病的，减产程度较小，对质量影响较大。移栽后10 d开始发病的，在20 d后植株不同程度死亡，引起严重减产(图1-d)。从田间集中发病及具有明显的发病中心的情况表明，种苗带病及移栽后进一步传播是陆良意大利生菜斑萎病发病率较高的原因。

2.2 陆良莴苣类蔬菜斑萎病样品中的主要病毒种类

对采集的样品进行负染色制样，电子显微镜观察发现主要含有直径80～90 nm的被膜球形病毒粒体，大部分病毒粒体呈簇状聚集，外层有囊泡包裹，是典型的orthotospoviruses粒体的形态特征(图2-a)。超薄切片制样，电子显微镜观察发现无症样品细胞中，叶绿体、线粒体等亚细胞结构完整，细胞质中无病毒粒体分布(图2-b)；具斑萎病症状样品细胞质中分布大量直径约85 nm的球形病毒粒体，有双层膜的单个病毒粒体，大部分为多个粒体聚集于内质网膜参与形成的囊泡中，具有典型的TSWV侵染的细胞内病毒粒体聚集特征(图2-c)[13]。结合症状分析，推测陆良莴苣类蔬菜斑萎病由orthotospoviruses侵染引起。应用滇中地区发生普遍的7种orthotospoviruses的抗体进行ELISA检测，结果表明，陆良莴苣类蔬菜斑萎病样品中伴随的病毒种类是TSWV(表2)。

a: 斑萎病样品的负染色观察；b: 无症对照样品的细胞病理切片观察；c: 斑萎病样品的细胞病理切片观察; V: 病毒粒子

a: 鬼针草花叶黄化； b： 烟草斑萎；c： 辣椒花叶； d: 马铃薯褪绿斑萎

表2 莴苣类蔬菜及其它植物斑萎病样品的ELISA检测结果

2.3 侵染陆良莴苣类蔬菜的TSWV的主要中间寄主植物

应用7种orthotospoviruses的抗体对莴苣类蔬菜地周围采集的鬼针草、马铃薯、辣椒疑似斑萎病样品检测(图3)，表明这些样品被TSWV侵染(表2)。从TSWV在田间的发生流行特点分析，上述杂草及作物是侵染陆良莴苣类蔬菜的TSWV的中间寄主植物。

2.4 陆良莴苣类蔬菜斑萎病的侵染循环

对大棚育苗的意大利生菜种苗应用TSWV单克隆抗体进行ELISA检测。结果表明，7株样品中有7株呈阳性反应，即TSWV种苗带毒率为100 %。

陆良地处中高海拔冷凉气候类型，在12月份至翌年1月份由于气温偏低，多种作物不能生长，只有鬼针草等部分杂草周年生长，且分布广泛。综合以上实验结果分析，感染TSWV的鬼针草是陆良莴苣类蔬菜斑萎病的初侵染源，在生菜等育苗季节(一般为每年3月份至10月份)，通过传毒介体蓟马传播到莴苣以及马铃薯、辣椒、烤烟等中间寄主植物上。带毒种苗在田间种植过程中，通过蓟马与农事操作进一步形成多次侵染。到后期发病率不断提高，危害加剧。TSWV在陆良莴苣秋蔬菜生产区以鬼针草-莴苣种苗-莴苣大田生长植株/中间寄主作物(马铃薯、辣椒、烤烟等)-鬼针草形成侵染循环。

3 讨 论

莴苣类蔬菜病毒病在全球范围内因区域不同有较大差异，除LMV、DYMV、CMV、TSWV外，其它地区报道的还有莴苣黄花叶病毒(LYMV)、莴苣坏死曲叶病毒(LNLCV)、番茄不孕病毒(TAV)、莴苣褪绿病毒(LCV)、莴苣坏死黄化病毒(LYNV)、凤仙花坏死斑点病毒(INSV)、莴苣斑驳病毒(LMoV)[14-18]。其中，INSV属于Orthotospovirus，同样由蓟马传播，在澳大利亚生菜生产中危害严重。

云南莴苣类蔬菜病毒病原目前鉴定的仅有TSWV[9]，在全省莴苣类蔬菜产区广泛发生分布，是云南莴苣类蔬菜病毒的优势种，早期侵染导致植株枯死，造成严重的产量损失，中后期侵染在叶部和莴笋茎韧皮部产生坏死斑点，对莴苣产量和质量造成不同程度的损失。对陆良县莴苣类蔬菜生产调查中，还发现由于病毒病发生危害严重，菜农误施或过量施用化学农药与激素的问题极为突出，农药残留超标问题严重。由于生菜、油麦菜、莴笋等莴苣类蔬菜是云南高原夏秋外销蔬菜的大宗产品，斑萎病的发生与农药残留超标严重制约菜农增收。目前对莴苣类斑萎病尚无特效的防治农药，前期研究表明，植物源天然产物类二萜化合物对烟草花叶病毒(TMV)具有明显的抑制活性[19]，可作为预防莴苣类斑萎病的生物源抗病毒制剂。明确莴苣类蔬菜斑萎病的初侵染源、侵染循环途径，对于开展早期监测预防和绿色防控技术措施的制定和实施、促进菜农稳产增收具有重要的指导意义。

4 结 论

本研究明确了陆良莴苣类蔬菜斑萎病主要由TSWV侵染引起。鬼针草是重要的初侵染源，通过传毒介体蓟马传播到莴苣类种苗及马铃薯、辣椒、烟草等作物上，并通过传毒介体蓟马和农事操作继续在这些作物上形成多次侵染，发生危害逐渐加剧，TSWV在鬼针草中越冬，形成翌年的初侵染源。因此，对初侵染源尤其是莴苣类蔬菜苗棚周围的鬼针草防除将有效减轻病毒的传播，同时，必须加强苗期传毒介体蓟马的防治，对种苗进行适时监测与预防，筛选应用无病毒或低带毒率种苗，从源头控制TSWV的危害。在大田生产期，应加强早期检测和监测预警，应用黄蓝板、性信息诱集素杀虫灯等加强对蓟马的防治，应用低毒低残留及生物源抗病毒农药或制剂预防斑萎病，对提高莴苣类蔬菜的产量、质量、绿色食品牌的创建具有重要意义。