芸苔素类物质生物学活性比较研究与评价

王强锋，李 芹，夏中梅，陈 春，邓自圆，林 杨，侯 勇，王海涛

(四川省农业科学院生物技术核技术研究所，四川 成都 610066)

【研究意义】芸苔素甾醇类(Brassinosteroids，BRs)部分化合物具有促进植物细胞伸长、细胞分裂、生殖发育、光形态建成，增强植物抗逆性的生物活性[1]。具体有以下几方面的生理效应：①调节维管组织分化，促进茎部生长，促进叶片发育，增强光合效率；②促进侧根和根毛的发育；③可提高植物雄性器官育性，促进种子灌浆和果实成熟，促进种子萌发；④调节植物体内氧化代谢，提高植物对水分、温度、盐分、重金属等多种非生物胁迫的适应性[2-4]；⑤促进植物对矿质养分的吸收，提高植物营养物质利用效率[5]。因此，芸苔素甾醇参与调节植物生长多个生理过程，对植物生长发育具有重要作用。自1970年Mitchell等从油菜花粉中提取的高活性生理物质被Grove等鉴定为芸苔素内酯(Brassinolide，BL)后[6-7]，随着植物提取分离技术的改进和实验手段的提高，人们又陆续发现了24-表芸苔素内酯(24-epibrassinolide，EBL)、28-高芸苔素内酯(28-homobrassinolide，HBL)、芸苔素甾酮(Brassinosterone，BRO)、28-脱甲基芸苔素内酯(28-norbrassinolide，NBL)等在植物体内广泛存在的天然芸苔素活性物质，至今已发现植物体内存在67种天然芸苔素类物质和15种合成前体物质[8-10]。芸苔素类物质的生物活性与其分子构型、手性中心、官能团构象与取代位置有直接关系，在已知的这些结构中芸苔素内酯、24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、芸苔素甾酮等对植物具有较高的生长调节活性[11]。目前，采用仿生化学制备技术可获得芸苔素类物质130余种，其生物学活性差异主要来源于侧链C-24取代基的类型和C-22、C-23羟基的数目、构型[12-13]。在2016年以前，国内把这一类芸苔素活性物质统称为芸苔素内酯，并在农业部登记。因芸苔素类物质不同结构存在较大的活性差异，2016年国家工业和信息化部发布了芸苔素类物质相关应用制剂行业标准，对不同结构的芸苔素进行了明确区分，与国际上对这类物质的结构与命名保持一致。目前，在我国农业部登记注册，允许大田推广应用的芸苔素活性物质主要有24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯(28-epihomobrassinolide，EHBL)、22,23,24-三表芸苔素内酯(22,23,24-triepibrassinolide，TRBL)、14-羟基芸苔素甾醇(14-hydroxylated brassinosteroid，HOBR)等，对这些芸苔素类物质有关生物活性系统地比较研究，有利于精准用药，提高农业投入品利用效率，减少环境负担。【前人研究进展】目前，用于植物生理活性物质室内生物学活性鉴定方法主要有菜豆第二节间伸长法(Bean Second Internode，BSI)、水稻叶片倾斜法(Rice Lamina Inclination，RLI)、小麦叶片展开法(Wheat Leaf-unrolling，WLU)、萝卜幼苗伸长法(Radish Seedling Elongation，RSE)、番茄下胚轴伸长法(Tomato Hypocotyl Elongation，THE)等方法，不同活性物质对同一生物材料敏感度不一样，生物学响应差异也比较明显[14-15]。关于芸苔素类物质的生物活性鉴定，国内外学者通常选择菜豆第二节间伸长法或者水稻叶片倾斜法，已有的研究报道多为单一的方法对单一的某种芸苔素结构进行活性鉴定，还没有采用多种方法对多个芸苔素活性物质进行系统全面的生物活性评价方面的研究报道，尤其是我国目前有多个芸苔素活性物质在大田推广应用的情况下，开展对这些物质的生物学活性系统地评价与比较研究对生产实践具有较好的指导作用。【本研究切入点】采用不同的生物活性鉴定方法，系统地比较研究不同芸苔素类物质的生物活性，更客观地判断不同结构芸苔素类物质的生物响应效果。高活性的芸苔素类物质在农业生产上具有重要的应用前景，但如何使用、何时使用、使用剂量都还有待进一步探讨。【拟解决的关键问题】比较我国目前允许生产上使用的不同结构芸苔素类物质的生物活性，进一步探讨有利于作物生长的施用方式和施用浓度，为芸苔素类物质服务于农业生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物：水稻、绿豆、小麦(西农529)、芹菜(泰国四季白芹)、大豆(中黄37)。

供试药剂：24-表芸苔素内酯(EBL，纯度95.20 %)，28-高芸苔素内酯(HBL，纯度92.04 %)，28-表高芸苔素内酯(EHBL，纯度86.13 %)，22,23,24-三表芸苔素内酯(TRBL，纯度90.44 %)，由四川省兰月科技有限公司提供。14-羟基芸苔素甾醇(HOBR，0.01 %水剂)，购自成都新朝阳作物科学股份有限公司。

1.2 试验设计与处理

1.2.1 水稻第二叶片倾斜法鉴定芸苔素类物质活性 5种芸苔素类物质分别设20、40 μg·L-12个浓度处理，以清水为对照，共11个处理，每个处理重复3次，完全随机排列。

水稻种子经10 %的H2O2消毒30 min后，均匀播撒在润湿的滤纸上，在恒温恒湿箱中(温度35 ℃、湿度60 %)催芽，保持黑暗条件。出苗8～9 d后，选取长势一致的幼苗以第二叶叶枕为中心，剪取约2 cm的切段，于30 ℃黑暗条件下清水中浸泡24 h。将上述5种芸苔素类物质配制成相应浓度的溶液置于培养皿中，各浸泡20个切段，30 ℃黑暗条件下浸泡48h后测量叶片倾斜角度。

1.2.2 绿豆上胚轴伸长法鉴定芸苔素类物质活性 5种芸苔素类物质分别设20、40 μg·L-12个浓度处理，以清水为对照，共11个处理，每个处理重复3次，完全随机排列。

绿豆种子经表面消毒后，置于TW-003型自动发芽机中催芽。待绿豆上胚轴生长至3 cm左右，选择长势一致(上胚轴长度相近)的幼苗剪取含顶芽、初生叶、上胚轴和下胚轴(3 cm)的插条。将上述5种芸苔素类物质配制成相应浓度的溶液置于塑料杯中，各放入8个插条培养48 h后测量上胚轴伸长量。

1.2.3 小麦叶片展开法鉴定芸苔素类物质活性 5种芸苔素类物质分别设5、20 μg·L-12个浓度处理，以清水为对照，共11个处理，每个处理重复3次，完全随机排列。

小麦种子经表面消毒后，置于TW-003型自动发芽机中催芽，保持黑暗。待小麦幼苗生长至7～8 cm，选择长势一致的幼苗去除叶片1.5 cm长的尖端，再剪下1 cm左右卷筒状幼叶。将上述5种芸苔素类物质配制成相应浓度的溶液置于塑料杯中，各放入15～20个切段黑暗条件下浸泡24 h，解剖镜下观察并测量叶片展开宽度。

1.2.4 芸苔素类物质不同施用方式对芹菜和大豆生长的影响 试验采用叶面喷施和灌根的方法，将0、1、5、10 μg·L-124-表芸苔素内酯 4个浓度处理施于芹菜，将0、0.05、0. 1、0.5、1 μg·L-124-表芸苔素内酯5个浓度处理施于大豆，每处理重复7次。

芹菜和大豆种子用咪鲜胺表面消毒，分别均匀播撒在铺有润湿滤纸的培养皿和育苗盘中催芽，出苗后用海绵固定，两叶一心时选择长势一致的幼苗移栽至均匀打孔的PVC管(内径7.0 cm，长100 cm) 中，每管7孔，每孔1株。采用华南农业大学叶菜营养液配方B培养，期间采用自然光照，并补充适量蒸馏水。待四叶一心时进行叶面喷施和灌根处理，处理前更换营养液，将相应浓度的24-表芸苔素内酯添加在营养液中充分混匀后进行灌根处理。7 d更换1次营养液，并进行第2次处理，整个生育期共处理2次。

芹菜于处理后30 d采样，大豆于成熟期采样，以单株为1次重复，每处理采集7个重复。样品经水冲洗擦干后，分为地下部和地上部。采用直尺测量法测定植株株高和根长，采用称量法分别测定地下部和地上部生物量，以鲜重计。其中大豆株高用茎部子叶痕到顶荚的距离表示。

1.3 数据处理与分析

采用DPS 11.0进行统计分析，LSD法进行多重比较(P<0.05)；Origin 9.0和Excel 2013进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 不同芸苔素类物质生物活性的差异

2.1.1 水稻第二叶片倾斜法 芸苔素类物质促进水稻叶片偏离茎部，形成一定角度(图1-A)，各倾斜角度的叶片相对数目可反映不同结构芸苔素类物质的活性差异(图1-B)。图1-B中，水稻叶片倾斜角度越大θ，条形图颜色越深，相应倾斜角度的叶片相对数目越多，芸苔素类物质生物活性越高。由图1可知，随芸苔素类物质处理浓度升高，水稻叶片倾斜角度越大，大角度叶片的相对数目增多。清水处理下12.2 %的水稻倾斜角度大于50°，各芸苔素类物质处理下15.2 %～89.3 %的叶片倾斜角度达50° 以上。可知 24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯和14-羟基芸苔素甾醇均促进水稻第二叶片倾斜。20 μg·L-1处理下，24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯促进水稻叶片倾斜150～180°；40 μg·L-1处理下，24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯和14-羟基芸苔素甾醇处理分别有22.9 %、35.7 %、5.9 % 和4.8 % 的叶片倾斜角度大于150°，22,23,24-三表芸苔素内酯处理未见叶片倾斜达150°。基于此，各芸苔素类物质促进水稻第二叶片倾斜的活性顺序为：28-高芸苔素内酯>24-表芸苔素内酯>28-表高芸苔素内酯>14-羟基芸苔素甾醇>22,23,24-三表芸苔素内酯。

2.1.2 绿豆上胚轴伸长法 由图2可知，芸苔素类物质可促进绿豆上胚轴伸长。除14-羟基芸苔素甾醇外，绿豆上胚轴伸长量随芸苔素类物质浓度升高而增加。24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯和22,23,24-三表芸苔素内酯处理下绿豆上胚轴伸长量显著高于对照，是清水处理的1.19～1.75倍；14-羟基芸苔素甾醇处理下绿豆上胚轴伸长量较小，是清水处理的81.2 %～68.8 %。不同浓度下，24-表芸苔素内酯处理绿豆上胚轴伸长量最大，28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯和22,23,24-三表芸苔素内酯处理下绿豆上胚轴伸长量差异不显著，14-羟基芸苔素甾醇处理下伸长量最小。20 和40 μg·L-124-表芸苔素内酯处理下，绿豆上胚轴伸长量分别是清水处理的1.56和1.75倍；而14-羟基芸苔素甾醇相应浓度处理分别是是清水的81.2 %和68.8 %。可见，芸苔素类物质促进绿豆上胚轴伸长的活性排序为：24-表芸苔素内酯>28-高芸苔素内酯、28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯>14-羟基芸苔素甾醇。

图中“EBL”表示24-表芸苔素内酯，“HBL”表示28-高芸苔素内酯，“EHBL”表示28-表高芸苔素内酯，“TRBL”表示22,23,24-三表芸苔素内酯，“HOBR”表示14-羟基芸苔素甾醇。下同

图中小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。下同

2.1.3 小麦叶片展开法 由图3-A可知，芸苔素类物质促进小麦叶片展开，随处理浓度升高，小麦叶片展开宽度越大。5种芸苔素类物质处理下，小麦叶片展开宽度差异明显，结合图3-B可发现各芸苔素类物质处理下小麦叶片展开宽度显著高于清水处理，是清水处理的1.25～2.10倍。随处理浓度升高， 24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯处理下小麦叶片展开宽度显著增加，28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯和14-羟基芸苔素甾醇处理浓度间差异不显著。处理浓度为5 μg·L-1时，24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯处理小麦叶片展开宽度差异不显著；28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯和14-羟基芸苔素甾醇处理差异不显著；24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯处理小麦叶片展开宽度均显著高于其他3种芸苔素类物质。处理浓度为20 μg·L-1时，24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯处理小麦叶片展开宽度显著高于28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯和14-羟基芸苔素甾醇处理；28-表高芸苔素内酯与22,23,24-三表芸苔素内酯处理下小麦叶片展开宽度均显著高于14-羟基芸苔素甾醇处理。综上，5种芸苔素类物质促进小麦叶片展开的活性的活性排序为：28-高芸苔素内酯>24-表芸苔素内酯>28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯>14-羟基芸苔素甾醇。

图3 芸苔素类物质处理下小麦叶片展开实拍(A)和展开宽度统计(B)

图4 叶面喷施和灌施24-表芸苔素内酯处理下芹菜长势

图5 24-表芸苔素内酯不同施用方式对芹菜株高(A)和根长(B)的影响

2.2 芸苔素类物质不同施用方式对作物生长的影响

2.2.1 叶面喷施和灌施对芹菜生长的影响 从图4，图5-A，图6可知，24-表芸苔素内酯不同施用方式对芹菜的生长具有较大影响，芹菜长势存在明显差异。叶面喷施1～10 μg·L-124-表芸苔素内酯有利于芹菜的生长，叶面喷施处理下芹菜长势优于灌根处理，植株较高，叶色深绿，株型紧凑，灌根处理使用过高浓度对芹菜有一定抑制。与对照相比，叶面喷施24-表芸苔素内酯叶面喷施有利于增加芹菜株高、提升植株地上部生物量。叶面喷施24-表芸苔素内酯，芹菜株高显著高于对照，是清水处理的1.03～1.19倍，地上部生物量达17.27～19.93 g株-1，10 μg·L-1处理下高出清水处理17.6 %。叶面喷施1～10 μg·L-124-表芸苔素内酯处理下，芹菜株高、根长均显著高于灌根处理。1～10 μg·L-1范围内，芹菜根系的伸长对24-表芸苔素内酯较为敏感，叶面喷施处理下芹菜根长和地下部生物量高于灌根处理。

图6 24-表芸苔素内酯不同施用方式对芹菜地上部(A)和地下部(B)生物量的影响

2.2.2 叶面喷施和灌施对大豆生长的影响 由图7可知，叶面喷施和灌施0.05～1 μg·L-124-表芸苔素内酯处理下大豆长势良好，结合图4芹菜的长势可知较低浓度的24-表芸苔素内酯有利于作物的生长，对作物生长的调节具有微量高效的特征。随叶面喷施浓度的升高，大豆株高、地上部生物量显著增加，低浓度灌施处理下大豆株高和生物量增加(图8～9)。叶面喷施0.5、1 μg·L-12,4-表芸苔素内酯大豆株高显著增加，分别是清水处理的1.10、1.21倍；灌施0.05、0.1和0.5 μg·L-124-表芸苔素内酯大豆株高显著增加，分别是清水处理的1.21、1.20和1.15倍。叶面喷施1 μg·L-124-表芸苔素内酯比灌施有利于大豆地上部增高，是灌施相同浓度24-表芸苔素内酯的1.14倍。灌施0.05、0.1 μg·L-124-表芸苔素内酯处理下，大豆株高、地上部生物量与叶面喷施1 μg·L-124-表芸苔素内酯处理下差异不显著，灌施较低浓度24-表芸苔素内酯可有效促进大豆地上部的生长。0.05～1 μg·L-124-表芸苔素内酯两种施用方式处理对大豆根长无明显影响，叶面喷施0.05～1 μg·L-1和灌施0.05～0.1 μg·L-1处理下大豆地下部生物量显著提高，是清水处理的1.08～1.26倍。综上所述，叶面喷施和灌施0.05～1 μg·L-124-表芸苔素内酯均有利于大豆地上部的生长，灌施适宜浓度低于叶面喷施。

图7 叶面喷施和灌施24-表芸苔素内酯处理下大豆长势

图8 24-表芸苔素内酯不同施用方式对大豆株高(A)和根长(B)的影响

图9 24-表芸苔素内酯不同施用方式对大豆地上部(A)和地下部(B)生物量的影响

3 讨 论

3.1 芸苔素类物质的生物学活性评价

芸苔素类物质的生物学活性主要取决于其化学结构特征，包括取代基类型、手性构象、官能团种类等的差异，其生物活性会存在明显的差异[16-17]。已有的研究表明，芸苔素类物质侧链C-22、C-23具有R构型的双羟基、C-24取代基呈S构型具有较高的生物活性[11-12]。如芸苔素内酯、24-表芸苔素内酯、28-高芸苔素内酯具有类似的活性结构或活性中心，是目前普遍认为生物活性最高的芸苔素类物质[18]。植物对芸苔素类物质的信号感应与传递存在独特的机制，而某些人工合成的芸苔素类物质在植物中并未发现有与之相同的天然芸苔素结构，如28-表高芸苔素内酯、22,23,24-三表芸苔素内酯等，但依然表现了一定的生物学活性。因此，芸苔素类物质的生物活性可能受植物种类、受体蛋白、竞争性抑制等因素的影响而不同[19]。本研究采用水稻、绿豆、小麦为供试材料，从多角度系统地鉴定了5种芸苔素类物质的活性，比较不同芸苔素类物质生物活性的差异。结果表明，水稻第二叶片倾斜法、绿豆上胚轴伸长法和小麦叶片展开法均可有效鉴定5种芸苔素类物质的活性，不同结构的芸苔素类物质生物活性具有较大差异。本研究中，24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯处理下水稻叶片倾斜角度、绿豆上胚轴伸长量、小麦叶片展开宽度均高于其他3种芸苔素类物质，表现出较高的活性。芸苔素类物质促进水稻叶鞘两侧生长速度不一致，导致叶片逐渐偏离茎部，倾斜角度能够较好地反应芸苔素类物质的活性[19-20]。在一定范围内，水稻叶片倾斜角度与芸苔素类物质浓度存在线性关系[21]。本研究中5种芸苔素类物质处理下水稻叶片倾斜角度随处理浓度升高而增大，28-高芸苔素内酯和24-表芸苔素内酯促进水稻叶片倾斜的活性较高。目前，这2种天然结构已经通过化学技术实现规模化生产，并在农业生产上得到广泛应用，取得了显著的调控效果。

3.2 芸苔素类物质对植物根、叶生长的影响及施用方法

植物体内芸苔素类物质的种类和含量取决于植物的组织特性，在植株各部位均可合成，并通过长距离运输影响全株的生长[22-23]。用芸苔素类物质处理绿豆(Mung bean)下胚轴可促进上胚轴的伸长[24]，蘸根可提高叶片酶活性和叶绿素，促进全株生物量增加[25]，叶面喷施适宜浓度芸苔素类物质可促进水稻侧根和根毛发育[26]。本研究绿豆上胚轴伸长法鉴定芸苔素类物质生物活性也证实了芸苔素类物质并非只是原位发生生理作用，因此，在农业生产中采用不同施用方式/施用于不同部位均可促进作物的生长。本研究中，叶面喷施和灌施24-表芸苔素内酯均促进大豆株高和地上部生物量的提升。

在植株叶片中，芸苔素类物质能同时促进光系统II反应中心的电子传递和Rubisco的羧化活性, 并调节气孔发育，增加CO2的同化[27-28]。叶面喷施芸苔素类物质可增加作物的叶绿素含量、光合速率以及碳水化合物含量，提高叶片净光合速率，促进作物生长[29]。在植物根系中，芸苔素类物质可调控根尖分生组织(root apical meristem，RAM)分化以及根的伸长过程，影响不定根发生、侧根发育、根毛形成、根尖重力反应等[30]。植物根内芸苔素类物质本身含量较低，加之植物根对芸苔素类物质的反应比植株其他部位更为敏感，因此较低浓度芸苔素类物质有利于调节植物根系发育[31-32]。较低浓度的芸苔素类物质可促进根系分生区细胞伸长和侧根原基生长速率加快，进而增加根系长度和数目[33-34]。本研究对芹菜使用1～10 μg·L-124-表芸苔素内酯处理，对大豆使用0.05～1 μg·L-124-表芸苔素内酯处理，大豆根系发育较优，根长和生物量增加。可知，芸苔素类物质适宜使用浓度一方面与作物本身的敏感性有关，另一方面芸苔素类物质微量高效，对植物根系的生长存在剂量效应[26,35]。结合芹菜和大豆地下部的长度和生物量来看，较低浓度(≤ 0.1 μg·L-1)的24-表芸苔素内酯促进作物根系的生长，同时可显著提升作物的株高和地上部生物量。总体来说，叶面喷施和灌根芸苔素类物质在农业生产中均可促进作物生长，但灌根使用浓度较叶面喷施更低。不同芸苔素类物质活性差异较大，因此，农业生产中应用芸苔素类物质应根据其活性和施用方式综合考虑使用浓度。

4 结 论

3种生测方法均有效鉴定不同芸苔素类物质的生物活性，24-表芸苔素内酯和28-高芸苔素内酯生物活性较高。叶面喷施和灌根24-表芸苔素内酯有利于作物的生长，灌根处理适宜浓度低于叶面喷施。不同结构芸苔素类物质活性差异较大，农业生产中芸苔素类物质使用浓度应根据活性和施用方式综合考虑。