‘唐元韭黄’采后常温货架期致腐病原菌的分离与鉴定

王祖莲，陈 晴，李焕秀，罗芳耀，朱永清，郭云建，高 佳*

(1.四川省农业科学院农产品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川农业大学园艺学院，四川 成都 611130；3.成都市郫都区农业农村和林业局，四川 成都 611730)

【研究意义】韭黄，百合科(Liliaceae)葱属(Allium)多年生草本植物，又名韭芽、黄韭芽等，是韭菜(A.tuberosumRottl. ex Spreng.)的宿根通过无光软化栽培生产的一种特色蔬菜，其叶片黄白、质地细嫩、香气浓郁，在我国多地广泛栽种[1]。韭黄富含丰富的维生素、蛋白质、矿物质以及挥发性硫化物，具有较高的营养和保健价值，用于食疗有温中、行气、散血、解毒等功效[2-3]。四川韭黄栽培历史悠久，其中成都市郫都区唐元镇被誉为“四川省韭黄之乡”[4]，‘唐元韭黄’更是被授予国家地理标志保护产品称号，远销国内外。‘唐元韭黄’叶片生长较长，通常可达60～80 cm，质地脆嫩，含水量高，采后呼吸代谢旺盛，商品化处理和贮运过程中易受机械损伤，造成叶片折断破损，夏季高温下放置2～3 d就会产生萎蔫、软化、腐烂、霉变等现象，极大地限制了产品的销售半径。【前人研究进展】目前，国内外关于韭黄采后研究的报道较少，集中在采用丙二醛[1]、二氧化氯[5]、1-甲基环丙烯(1-MCP)[6]等不同的化学保鲜剂或保温箱[7]等物理设施来延长产品货架期上，而关于导致韭黄采后由病原菌引起的腐损关注较少。韭黄种植过程中需要对韭菜宿根进行避光覆盖软化栽培，高温、高湿环境下田间携带的病原菌种类和数量较多。研究显示韭黄种植过程中发现的由烟草疫霉寄生变种交配型A1(Phytophthoranicotianaevar.parasitica)引起的韭黄烂叶病[8]，也有研究报道韭菜种植过程中发现了黄叶病(草生欧文氏菌菠萝变种Erwiniaherbicolavar.ananas)[9]、绵疫病(樟疫霉PhytophthoracinnamomiRand)[10]、白绢病(SclerotiumrolfsiiSacc.)[11]、灰霉病(葱鳞葡萄孢菌BotrytissquamosaWalker)[12]、根腐病(镰孢菌Fusarium)[13]等。【本研究切入点】韭黄采前病害的种类受种植环境与栽培条件影响较大，采前病害与采后病害有相关性也存在差异。【拟解决的关键问题】因此，本文以‘唐元韭黄’为研究对象，初步分离鉴定了导致韭黄采后腐烂的主要病原菌，以期为探明四川地区韭黄采后致腐病原菌种类提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病害调查及病原菌分离、纯化和保藏 2018年9月，采集四川省成都市郫都区唐元镇青杨韭黄专业合作社的新鲜无病症的叶片，置于常温[(20±0.5) ℃]下72 h，后调查病害发生情况，并描述病害症状。

致病病原菌分离于贮藏过程中具典型发病症状的韭黄叶片上，在无菌操作台上纯化菌株，分离培养温度分别为30 、37 ℃，分离好的菌株防置于4 ℃的冰箱进行短期贮藏。

1.1.2 化学试剂 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和平板计数琼脂(PCA,北京陆桥技术股份有限公司)；革兰氏染色料(杭州微生物试剂有限公司)；香柏油分析纯(中国上海懿洋有限公司)；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；琼脂糖(上海玉博生物科技有限公司)；氯化钠、无水乙醇等常规试剂为分析纯(成都市科隆化学品有限公司。

1.1.3 设备仪器 高压灭菌锅MM400[致微(厦门)仪器有限公司]；生物安全柜ESCD class Ⅱ BSC AC 2-6S1[新加坡艺思高科技有限公司]；恒温培养箱LRHS-150-Ⅱ(上海跃进医疗器械有限公司)；显微镜OLYMPUS CX41RF[奥林巴斯(中国)有限公司]；PCR仪FlexCycle(德国耶拿分析仪器股份公司)；冷冻离心机5424[Eppendorf (中国)有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 致腐病原菌的分离与纯化 (1)致腐病原菌的分离。常温贮藏的发病韭黄，经无菌水清洗后于滤纸上晾干，采用组织分离法[14]，将分离的韭黄感病组织置于PCA及PDA培养基上，于37 ℃或30 ℃恒温培养2～3 d。

(2)致腐病原菌的纯化。PDA培养基：待分离的病原真菌菌落生长至直径1 cm时，切取菌落外端菌丝与培养基相接触的菌块，挑取菌块放置在新的PDA培养基上重新培养，以上步骤重复3次。

PCA培养基：采用点接法[15]进行纯化备用。

1.2.2 致病性鉴定 对接种点采用“针刺”和“不处理”2种方式将分离的纯培养物接种于健壮的韭黄叶片上，25 ℃下培养3～5 d，待发生腐烂现象后，从腐烂处分离致腐病原菌，与自然发病的症状进行比较，并通过韭黄产生病害的发展速度和发展程度，评价其病原菌对韭黄的致病能力[16]。

1.2.3 致腐病原菌形态学鉴定 (1)致腐病原菌的形态学特征观察。将分离出的真菌和细菌分别接种于PDA及PCA培养基上，放置于37 和25 ℃下培养5～7 d，记录菌落形态特征和颜色。

(2)致腐病原菌的显微特征观察。将培养好的真菌直接制片，细菌经革兰氏染色后制片，在显微镜下观察，记录其特征。

1.2.4 致腐病原菌的分子生物学鉴定 将韭黄采后主要致腐病原菌分别置于PDA和PCA培养基上培养，并纯化得到单一菌株，在相应的液体培养基振荡培养3～5 d，采用上海生工真菌、细菌基因组DNA抽提试剂盒(Ezup柱式)分别提取DNA。rDNA ITS扩增分别采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，以及细菌核糖体基因转录间隔区(16S rDNA)通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应体系及PCR反应程序参考试剂盒说明。将PCR产物进行电泳检测，然后送样至生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST软件与数据库中的已知序列进行同源性比较，再利用MEGA软件构建进化树。

2 结果与分析

2.1 自然发病表现症状及发病特点

将韭黄放置在常温(25±0.5)℃下贮藏，3～5 d就会出现腐烂现象(图1)。韭黄白霉(图1-a)多从萎蔫叶片上发病，先产生大量白色菌丝，后逐步扩散导致周围叶片迅速萎蔫失去商品价值。黑斑症状(图1-b)，以韭黄茎受害为主，初期呈针尖状褐色小斑，后逐渐扩散呈明显的黑色斑点，有的病斑后期会产生白色的霉状物，导致贮藏后期韭黄茎商品性降低并软化易折损。

黑斑病是农作物的主要真菌性病害之一，在百合科植物上也较常见，石蕴琏等[17]对蒜薹贮藏期黑斑病研究表明，其初期症状呈“针尖状”小黄斑，少数中间凹陷，病斑产生褐色或黑褐色霉状物，其病原微生物经鉴定为匐柄霉{StemphyliumbotryosumWallr.[st.perf.=Pleosporaherbarum(Fr.)Rabenh.]}。水烂症状(图1-c)是引起韭黄商品性劣变的主要病害现象之一，主要发生在韭黄叶片上。发病时先从幼嫩叶片边缘产生水浸现象，1～2 d后迅速扩散至整叶乃至整株植株，并伴随着大量组织粘液的渗出和刺激性不良气味产生，茎秆和叶片软腐。现有研究关于韭黄采后病害报道较少，尚未查见有关水烂症状的描述，但在韭菜田间栽种时有报道过类似的一种暗褐色水渍状真菌病斑，其病部出现白色霉层，易引起叶片下垂腐烂，病原微生物经鉴定为疫霉属(Phytophthora)真菌[18]；此外也有报道在当归的田间种植时出现“水烂病”，其症状为叶基部呈水渍状，然后萎蔫导致整个植株地上部分枯死，地下根腐烂，病原微生物经鉴定为荧光假单胞杆菌第2生物型(Pseudomonas fluorescens 生物型Ⅱ)[19]。

2.2 室内回接表现症状及致腐病原菌的鉴定

2.2.1 致腐病原菌的分离和纯化 从出现先病症的韭黄样品中分别对“水烂”、“白霉”以及“黑斑”分别取样分离，然后根据平板上的菌落特征对分离的致腐病原菌进行纯化培养，分离得到1株细菌和1株真菌。

2.2.2 致腐病原菌的确定 依柯赫氏法则[16]将分离的1株细菌和1株真菌分别接种到新鲜健康的韭黄上进行致病力鉴定，初步确定这2种病原菌具有较强的致病力，分别编号为j-1、j-2。重新将这2株菌接种到新鲜健康的韭黄茎秆上，再次从接种后腐烂的韭黄组织分离致腐病原菌，纯化培养得到与j-1和j-2形态相似的病原菌。

将分离到的菌株分别采用“有伤”和“无伤”2种接种方式[20]回接到健康韭黄茎秆上，置于25 ℃室内货架存放3 d，观察到接种j-1菌丝块的韭黄茎全部发生腐烂现象，且有伤接种比无伤接种发病更快(图2-a)；接种j-2细菌的韭黄茎在接种后5 d时，有伤接种的腐烂发生率超过80.00 %，但无伤接种未出现明显症状，对照组也未发病(图2-b)。将腐烂的韭黄再次进行致腐病原菌的二次分离，得到与接种菌形态相同的致腐病原菌。根据柯赫氏法则[16]，证明j-1和j-2两株接种菌都是导致韭黄腐败的致腐病原菌，且与自然发病的症状相似；菌株毒力测定结果表明，j-1菌株的致病性比j-2菌株强。

a.韭黄叶片长霉症状；b.韭黄茎秆黑斑症状；c.韭黄水烂症状

a.j-1致病性鉴定；b.j-2致病性鉴定

2.2.3 致腐病原菌的鉴定 (1) 致腐病原菌形态特征的鉴定。j-1菌株为真菌，在PDA培养基上30 ℃恒温培养5 d后，直径达60 mm左右。其菌落呈规则圆形(图3)，同心圆纹状，菌丝生长紧密，部分表生颜色为粉白色，部分埋生背观颜色为粉色，随着温度湿度的变化，菌落颜色可能会发生改变。显微镜下，其菌丝为有隔菌丝，产孢细胞为单瓶梗，常产生大量的小型分生孢子大小为2.5～5.0 μm，呈肾形或卵形。未观察到大型分生孢子和厚垣孢子。参考真菌形态特征系统分类的相关资料[21]，初步鉴定菌株j-1为镰刀菌属。

j-2菌株为细菌，在PCA培养基上37 ℃培养3～5 d后，菌落直径达到1 cm左右(图4)，菌落近乎圆形，边缘呈锯齿形，整个菌落外一圈近乎透明，且有光泽，而内圈呈淡黄色凸起状。经革兰氏染色(图4-c，d)鉴定j-2为杆状革兰氏阴性菌，专性好氧菌。

a.j-1正面形态特征；b.j-1背面形态特征；c.j-1菌丝孢子特征；d.j-1孢子；e.j-1菌丝

a.j-2正面形态特征；b.j-2背面形态特征；c.光学显微镜下j-2的菌体形态；d.光学显微镜下j-2革兰氏染色的菌体形态

a.j-1菌株；b.j-2菌株

(2) 致腐病原菌rDNA iTS及16S rDNA扩增及序列分析。提取j-1菌株的DNA模板，利用引物ITS1和ITS4对j-1进行PCR扩增，得到了500 bp左右的条带(图5)。对j-1进行测序后，将所得到的序列使用NCBI上数据库中的BLAST进行比对分析(图6)。结果表明，与j-1比对结果为100.00 %的菌株种类均为Fusariumoxysporum，其中同源性菌株的登录号有MK192050.1、KY114145.1、KU939047.1、KU939046.1、KY775616.1、KX253980.1、KR7086 47.1、EU839382.1、EU839372.1和EU839365.1。结合j-1形态特征的观察，最终确定其为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。

提取j-2菌株的DNA模板，利用引物27F和1492R对j-2进行扩增得到1300 bp左右的条带(图7)。对j-2进行测序后将所得到的序列结果在NCBI上的数据库中进行BLAST比对分析(图6)，与j-2比对结果为97.90 %的菌株种类均为黄单胞杆菌属(Xanthomonadales)的变形菌，其中具有遗传相似性的菌株的登录号有NR 157765.1、NR 121739.1、NR 028930.1、NR 116793.1、NR 148818.1、NR 116366.1、NR 117406.1、NR 136457.1、NR 025577.1和NR 134219.1；其中与登录号为NR 157765.1的亲缘关系最近(支持率为97.90 %)，其为嗜麦芽单胞菌(Stenotrophomonasbentonitica)，与登录号为NR 025577.1以及NR 134219.1的亲缘关系较远。结合j-2形态特征的观察，最终确定其为黄单胞杆菌属(Xanthomonas)中的一种嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)。

图6 j-1 rDNA ITS序列聚类图

图7 j-2 rDNA ITS序列聚类图

3 讨 论

由病原微生物引起的腐烂是造成果蔬采后腐损的主要原因之一，其中镰刀菌属微生物因广泛存在于土壤和植物体内，成为腐败菌的重要来源[21-23]。Tonti等[24]的研究表明，镰刀菌属(Fusarium)是引起大蒜采后贮藏过程中腐烂的主要病原菌种类；李旭双等[25]研究显示，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和层生镰刀菌(F.proliferatum)是导致大蒜出现水浸状病斑的主要致病菌，病斑产生后逐步蔓延至整个蒜瓣，使蒜瓣呈现黄褐色和干缩现象。对洋葱采后病害的分离鉴定表明[26]，引起洋葱腐烂的主要病原微生物为曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)和根霉属(Rhizopus)4类，其中以曲霉属和根霉属为主。张军高等[27]从贮藏期大葱腐败组织中分离鉴定出层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)、尖孢镰孢菌(FusariumoxysporumSchlecht)和燕麦镰孢菌(F.avenaceum)3种致腐病原菌，其中层出镰孢菌为大葱镰孢菌腐烂病的优势致病菌，分离频率为52.50 %。此外，细菌性病害也是导致百合科葱属植物腐烂的主要原因之一。Tomlinson等[28]报道金黄色假单胞菌(Pseudomonascepaci)可以引起受伤的洋葱球茎发生软腐病；张郑等[29]研究表明，假单胞菌属(Pseudomonassp.)和洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)会导致洋葱鳞茎腐烂性病害的发生。

本试验从货架贮藏过程中韭黄的“白霉水烂”和“黑斑”症状腐烂材料中分离出尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)致腐病原菌，与前人对大蒜干腐病[26]、洋葱腐烂[25]等百合科葱属蔬菜采后病害的研究结果相似。但本试验在韭黄“水烂”症状植株上还分离鉴定出一株黄单胞杆菌的变形菌嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)，该菌尚未在百合科葱属植物上有研究报道。有研究表明，黄单胞杆菌是造成油豆角贮藏期腐烂[30]和李细菌性穿孔[31]的主要致病病原菌。

4 结 论

本试验从韭黄常温货架贮藏过程中的腐烂植株中分离鉴定出2株致腐病原菌，分别编号为1株真菌j-1和1株细菌j-2。经致病性鉴定表明，真菌j-1菌株对韭黄的致腐率达100.00 %，是导致韭黄腐烂的主要致腐病原菌；细菌j-2菌株对韭黄有伤接种的致腐率大于80.00 %，也是导致韭黄腐烂的重要致腐病原菌。对j-1和j-2菌株进行形态学特征鉴定和rDNA的ITS序列分析，证明j-1菌株为镰刀菌属(Fusarium)中的尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)，j-2菌株为黄单胞杆菌属(Xanthomonas)中的嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)。