温度响应上位抑制草莓开花基因FaDSF遗传模型分析

阮继伟，孙建丽，万 红，单芹丽，田林孟，蒋海玉，杨春梅*

(1.云南省农业科学院花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650205；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3.云南省农业科学院园艺研究所，云南 昆明 650205；4. 云南省农业科学院农业经济与信息研究所，云南 昆明 650205)

【研究意义】温度和光周期是诱导凤梨草莓(Fragaria×ananassaDuch., 2n=8x=56)开花的主要环境信号[1-4]。根据开花习性的不同，凤梨草莓可分为季节性草莓(Seasonal-flowering，SF)和四季草莓(Perpetual-flowering, PF)。季节性草莓也称短日照草莓，其在秋季低温短日照条件下完成花芽分化并在冬春季开花结果，而在夏季长日照条件下花芽分化停止，夏秋季不开花结果[5-7]；四季草莓在(适宜生长温度)夏季长日照条件下也可完成花芽分化并开花结果，从而扩展果实采收期[8-10]。对关键性状的遗传解析是支撑精细化育种与定向遗传改良的基础。凤梨草莓为异源八倍体，其基因组组成复杂, 其中来自森林草莓(Fragariavesca)的亚基因组具有亚基因组优势(Sub-genome Dominance)，导致很多性状的遗传表现出二倍体的遗传现象[11]。虽然四季草莓品种有不同的来源[1,5,9,12-13]。但最新的系列研究表明，不同来源的四季草莓夏季开花性状受控于同一主效位点FaPFRU的调控[14-20]。【前人研究进展】然而，当利用紧密连锁的Bx083_206，Bx215_131[17,20]，FANhyb19.1-15-21和 FANhyb19.1-15-21[21]等分子标记来预测植株开花表型时，阴性标记可准确预测季节性植株；而阳性标记的植株仅45 %～85 %表现四季性。Lewers 等[21]基于多(4)年多(67)杂交群体表型评价，依据亲本基因型(分子标记)和表型(四季性或季节性)预测后代表型分离比例，并与实际分离比例比对分析后认为至少有2个基因(分别为显性和隐性)上位抑制FaPFRU，导致部分具有FaPFRU显性分子标记的株系表现季节性。其中显性抑制基因(Dominant Suppressor Flowering,FaDSF)在播种当年表现出抑制效应，越冬之后FaDSF基因的抑制效应消失，即FaDSF基因具有响应温度信号调节开花的功能；FaDSF基因的抑制作用使一些杂交群体在播种当年四季性和季节性植株分离比例符合1∶3，而越冬之后年份的分离比例符合1∶1[21]。【本研究切入点】利用在不同年份先后2次杂交构建 ‘章姬’בAlbion’F1群体，母本是季节性草莓(基因型：pfrupfru)，父本是四季草莓(基因型：PFRUpfru)。在播种当年及越冬后的2个年份，调查群体表现四季性和季节性植株的分离比例，分析温度响应抑制开花基因FaDSF的分离和遗传模型。【拟解决的关键问题】探究FaDSF基因在‘章姬’בAlbion’群体中的分离情况和遗传模型，为FaDSF基因定位和分子遗传信息的挖掘提供分离群体和遗传模型支持，也为研究温度影响草莓开花的分子机理提供了一个切入点。

1 材料与方法

1.1 供试材料

季节性草莓品种‘章姬’和四季草莓品种‘Albion’定植于高架基质栽培槽内，按Ruan等[22]的方式管理植株。以‘章姬’作为母本，‘Albion’为父本分别于2013年10月和2017年10月杂交。母本花朵露白期(未开放)人工去雄，标记；父本花朵露白期取花蕾至室内干燥密闭环境保存获取花粉；人工隔离授粉，授粉后50 d左右杂交果实完全成熟，从成熟的果实上取杂交种子，洗净后放烘箱(上海博讯BGZ-240)内40 ℃烘干72 h。

1.2 试验设计

分别播种2次杂交构建的‘章姬’בAlbion’种子，成苗后定植于高架基质栽培槽内养护，调查播种当年，次年及第3年F1群体各单株开花性状，根据植株开花性状(四季性或季节性)的分离比例，分析FaDSF基因的遗传模型。

1.3 试验方法

实验地位于云南省玉溪市江川区九溪镇的云南农业科技园内(北纬24°18′，海拔1760 m)。2014年3月8日和2018年2月28日分别播种2013年和2017年杂交获得的‘章姬’בAlbion’种子，2014年5月8日和2018年4月20日分别将播种后成苗植株定植于高架基质栽培槽内，各单株分别标号；2个杂交群体按先后顺序分别命名为群体1(2013年杂交)和群体2(2017年杂交)。播种和养护参照Ruan等[22]的方法，群体1定植后植株一直养护到2016年数据调查结束；群体2定植后植株一直养护到2019年数据调查结束，2019年9-10月营养繁殖各单株子苗，并于11月重新定植用于2020年的数据收集。

1.3.1 开花性状调查 群体1：2015年(播种次年)和2016年(播种后第3年)7月1日至8月31日，参照Ruan等[22]的方法，调查群体内各单株萌发花序数；2015年有478株，2016年有455株。由于2014年播种晚，肥水管理不佳导致植株生长慢，2014年7月和8月群体内无任何植株萌发花序，调查群体内各单株(483株)第1花序萌发时间来确定植株的开花表型。

群体2：2018年(播种当年)，2019年(播种后次年)和2020年(播种后第3年)7月1日至8月31日，调查群体内存活各单株萌发的花序数。2018年292株存活，2019年有292株存活，2020年有274株存活。

1.3.2 开花性状分离比例及遗传模型分析 参照Ruan等[22]的方法，每年7月1日至8月31日，萌发2个花序的植株认定为具有四季开花习性，期间没有萌发花序或仅萌发1个花序的植株认定为具有季节开花习性。群体1植株2014年的开花表型根据第1花序萌发时间来确定。根据2杂交群体多年开花性状(四季性和季节性)分离比例，综合分析FaDSF基因遗传模型。

1.4 数据统计与分析

观察记录的原始数据采用Excel 2007进行处理和卡平方检测。

图1 群体1播种当年(2014年)第1花序萌发时间分布频率

2 结果与分析

2.1 杂交群体开花表型

群体1：2014年存活的483单株第1花序萌发时间为2014年9月至2015年1月，各月萌发花序的单株数见图1，其中2014年9月124株，10月29株，11月304株，12月21株，2015年1月5株。2014年9月和11月分别有1个峰值，根据正态分布规律，将9月萌发第1花序(124株)和10月1-15日萌发第1花序(8株)的132单株认定为具有四季性开花性状，其他植株(351株)认定为具有季节性开花性状。2015年存活的468株F1单株萌发花序数为0～20，其中萌发2个及以上花序的212株认定为具有四季开花性状；未萌发花序的194株，萌发1个花序的62株，共256株认定为具有季节性开花性状(图2-A)。2016年存活的455株F1代单株萌发花序数为0～39，其中萌发2个及以上花序的224株认定为具有四季开花性状；未萌发花序的190株，萌发1个花序的41株，共231株认定为具有季节性开花性状(图2-A)。

图3 群体2播种当年(2018年)夏季花序数分布频率

群体2：2018年存活的292株F1代单株萌发花序数为0～18，其中萌发2个及以上花序的80株认定为具有四季开花性状；未萌发花序的185株，萌发1个花序的27株，共212株认定为具有季节性开花性状(图3)。2019年存活的292株F1代单株萌发花序数为0～27，其中萌发2个及以上花序的144株认定为具有四季开花性状；未萌发花序的132株，萌发1个花序的16株，共148株认定为具有季节性开花性状(图2-B)。2020年存活的274株F1代单株萌发花序数为0～15，其中萌发2个及以上花序的130株认定为具有四季开花性状；未萌发花序的114株，萌发1个花序的30株，共144株认定为具有季节性开花性状(图2-B)。

2.2 杂交群体开花表型分离比例与遗传模型分析

图2 群体1(A)和群体2(B)播种后2年夏季花序数分布频率

表1 ‘章姬’ × ‘Albion’2次杂交F1群体中四季性和季节性植株分离情况

群体1：2014年群体表现四季性和季节性植株的分离比例符合1∶3(表1，χ2=1.40)，而在植株越冬后的2015年和2016年分离比例符合1∶1(χ2=2.42，0.11)。在2015年表现四季性的222株F1代单株中，102株在播种当年(2014年)表现四季性，120株表现季节性，分离比例符合1∶1(χ2=21.45)；在2016年表现四季性的224株F1代单株中，106株在播种当年(2014年)表现四季性，118株表现季节性，分离比例符合1∶1(χ2=0.64)。

群体2：2018年群体表现四季性和季节性植株的分离比例符合1∶3(χ2=0.89)，而在植株越冬后的2019年分离比例符合1∶1(表1，χ2=0.05)。在2019年表现四季性的144株F1代单株中，67株在播种当年(2018年)表现四季性，77株表现季节性，分离比例符合1∶1(χ2=0.69)；在2020年表现四季性的130株F1代单株中，69株在播种当年(2018年)表现四季性，61株表现季节性，分离比例符合1∶1(χ2=0.49)。

根据2个群体多年表型评价，发现在播种当年有1个基因，其上位抑制夏季开花性状；即在‘章姬’בAlbion’杂交群体中存在Lewers 等[21]报道的响应温度信号抑制开花的FaDSF基因。

3 讨 论

3.1 杂交群体开花表型及评价

夏季(7和8月)是否萌发花序是判断植株是否具有四季性的通用标准[23-24]。由于云南地处低纬高原夏季气候温和，季节性草莓品种‘章姬’及其自交群体植株有10 %在7和8月萌发1个花序[22]，故在本实验中，参照之前的经验[22]将萌发2个及以上花序的植株判定为具有四季性，不萌发或仅萌发1个花序的植株判定为具有季节性。

由于群体1在2014年播种晚，苗期及定植后肥水管理不佳导致植株生长慢，2014年7月和8月群体内无任何植株萌发花蕾，我们根据各单株第1花序萌发时间来确定植株的开花表型，萌发时间显示出2个峰值(图1)，将第1个峰值周围的植株(10月15日前萌发花序)的植株认定为具有四季性，第2个峰值周围的植株(10月15日后萌发花序)认定为具有季节性。

3.2 杂交群体开花表型分离比例与遗传模型分析

虽然四季草莓品种有不同的来源[1,5,9,12-13]。但最新的系列研究表明，不同来源的四季草莓夏季开花性状受控于同一主效位点FaPFRU的调控[14-20]。在前面的研究中[22]，通过季节性草莓‘章姬’和四季性草莓‘阿尔比’2个自交群体和1个杂交群体多年表型评价和遗传模型分析认为，四季草莓‘阿尔比’的基因型是PFRUpfru，而季节性草莓‘章姬’的基因型是pfrupfru, 他们的杂交后代中有一半的基因型是PFRUpfru，另一半是pfrupfru。这可以解释杂交群体中四季性和季节性植株分离比例符合1∶1。

在播种当年分别2次杂交构建‘章姬’בAlbion’F1群体，四季性植株和季节性植株的分离比例符合1∶3，这证明有另外一个基因在播种当年抑制植株表现四季性，这和Lewers 等[21]的研究结论是一致的。将这上位抑制植株开花的基因标记为FaDSF,以便下面的阐述。

由于FaDSF在播种当年具有上位抑制FaPFRU基因的作用，具有PFRUpfru基因型的F1代植株，理论上有一半的植株具有DSFdsf基因型，另一半具有dsfdsf基因新型。也就是仅理论上占杂交群体1/4的植株(基因型为PFRUpfrudsfdsf)在播种当年表现四季性；而杂交群体另外3/4的植株(基因型为PFRUpfruDSFdsf)在播种当年表现季节性。

参照和比对草莓属已有的开花调控途径，将有助于鉴定FaDSF基因并明确其分子调控网络。已有的研究成果对森林草莓和凤梨草莓开花的光周期调控分子途径“CO-FT-SOC1-TFL1”进行了深入阐述。在夏季长日照条件下，CO在叶片上调表达(栽培草莓暂无报道)，进而激活FT在叶片上调表达，再进而激活SOC1在茎尖上调表达，再进而激活TFL1在茎尖上调表达,TFL1是花芽分化的抑制基因(抑制花芽分化基因API和花蕾发育基因FT3表达)，其上调表达导致草莓植株花芽不分化[4,25-29]。森林草莓中FvTFL1基因第一外显子2个碱基的缺失导致FvTFL1基因不能转录从而使突变株夏季开花，表现四季性。栽培草莓中FaFT1同源基因FaPFRU基因的导入导致下游FaSOC1和FaTFL1下调表达，植株夏季开花，表现四季性。

然而，温度调控草莓开花的分子调控网络研究的很少。已有的研究推测温度通过“CO-FT-SOC1-TFL1”以外的其他调控途径，间接或直接调控TFL1基因并达到调控凤梨草莓和森林草莓开花的效应[3-4, 26]，但调控的路径和机理尚不清楚。Urrutia等[30]在导入布哈拉草莓(F.bucharica)部分基因的四季性森林草莓近等基因系(NIL)6号染色体上发现1基因有类似FaDSF的功能，即在播种当年抑制四季性，并推测其可能是FvTFL1。Koskela等[31]的研究证实FvTFL1启动子区域1碱基的缺失导致蛋白结合位点变化，使森林草莓特异株系(arctic woodland strawberry accession)需要较长时间的低温积累下调FvTFL1表达量后，植株才能感受外界开花信号分化花芽。

参照拟南芥，FLC，SVP和H2A.Z基因是感受温度信号调控开花基因[32-34]。其中SVP和H2A.Z蛋白感受温度信号在开花相关基因FT启动子区域富集，通过调控开花基因FT表达量调控开花。由于草莓属中未发现FLC同源基因[35]，考虑温度信号是否是通过FaSVP和FaH2A.Z基因介导间接调控FaTFL1基因达到调控凤梨草莓开花的效应。

如果着眼更宽的温度范围，只要低于光敏下限温度(≈15 ℃)，无论季节性和四季性草莓都能分化花芽；而高于光敏上限温度(≈26 ℃)，无论季节性和四季性草莓都不能分化花芽；在2个温度范围内，光周期调控才起作用[2,4,29,36-37]。森林草莓也有相同的温度调控现象[3,29]。

基于以上分析，在下一步的研究中至少有以下问题需要回答：响应温度信号的FaDSF基因是FaTFL1基因吗？抑或是调控FaTFL1基因的FaSVP或FaH2A.Z等基因？凤梨草莓不论日照长短，低于光敏下限温度促进开花而高于光敏上限温度抑制开花，FaDSF基因是否参与了这一现象的调控？回答这些问题需要针对FaDSF基因开展分子层面的研究，本研究证明在‘章姬’בAlbion’杂交群体中存在FaDSF基因分离群体，并阐述了其遗传模型，这为开展FaDSF基因定位和分子生物学研究提供了遗传群体和遗传模型支撑。

4 结 论

在‘章姬’בAlbion’杂交群体中存在温度相应抑制开花的FaDSF基因分离群体，其显性并上位抑制FaPFRU基因。这为开展FaDSF基因定位和分子生物学研究提供了遗传群体和遗传模型支撑，也为研究温度影响草莓开花的分子机理提供了一个切入点。