快速检测洋葱伯克霍尔德菌巢式荧光定量PCR法建立

林丽英 邓穗燕 郭旭光

洋葱伯克霍尔德菌复合体（Burkholderia cepaciacomplex，Bcc）由一组广泛分布于自然界和人工环境中的相关细菌组成，是革兰氏阴性、运动性和需氧菌，具有非发酵特性［1-2］。它们生活在自然界，特别是土壤、水和植物产品中，是多种抗药性的有机体，能抵抗许多消毒剂、清洁剂和防腐剂的影响［1］。Bcc还具有形成生物膜和污染塑料、金属、水系统以及制药设施的巨大能力［1］。近年来在临床检测中逐渐发现，洋葱伯克霍尔德菌是一种机会性病原体，主要在免疫低下人群中引起疾病。由其引起的最严重的疾病包括肺炎或细菌感染，这些疾病发生在免疫系统受损或慢性肺病患者身上，特别是囊性纤维化［3-5］。因此，如何方便检测出洋葱伯克霍尔德菌感染，将有利于临床用药治疗。尽管，对洋葱伯克霍尔德菌的分类研究已经改进了其鉴定，但将洋葱伯克霍尔德菌与其他相关分类群，如罗氏菌、铜毒菌、无色杆菌和短枝单胞菌等的区分仍然很困难［6］。在用于鉴定洋葱伯克霍尔德菌的分子方法中，基于recA基因的分析目前具有较高的分辨能力，能够比较有效区分Bcc 群内菌种［7］。因此，本研究根据已有检测方法进行改良，期望建立一种能直接快速进行临床检测洋葱伯克霍尔德菌感染的有效方法。

1 材料与方法

1.1 菌株与标本

洋葱伯克霍尔德菌标准株（ATCC 25416）、铜绿假单胞菌（ATCC 9027）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）、大肠杆菌（ATCC 8739）、沃氏葡萄球菌、藤黄微球菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、皮氏罗尔斯顿菌和阿邦尼沙门氏菌购自中国菌种保藏中心。35例痰标本来源于广州医科大学附属第三医院的囊性纤维化患者，所有患者均签署知情同意书，且本研究经本院伦理委员会批准进行。检测标本例数的确定根据诊断试验样本量计算公式进行计算，其中Z1-α/2=1.96，P=0.9 为敏感度，δ=0.1 为把握度，则达到统计差异所需样本量约为35。

1.2 基因组DNA 提取

根据细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书进行，先离心收集菌体，加入重悬液彻底悬浮。加入蛋白酶K 和裂解液，漩涡振荡混匀形成均一的悬浮液，65℃温浴10 min。加入无水乙醇上下颠倒混匀，然后转移到纯化柱中，12 000 rpm 离心1 min，弃滤液。加入去蛋白液和漂洗液洗涤，空甩以彻底去除纯化柱中残留的液体。向纯化柱中央处悬空加入50 μL洗脱液，室温放置2 min 后于13 000 rpm 离心2 min，管底即为高纯度基因组DNA。继续用分光光度计测得DNA 浓度，剩余样品可放置-20℃保存。

1.3 巢式荧光定量PCR

以提取基因组DNA 为模板，用外引物BCR1-F（5′-ATGACCGCCGAGAAGAGCAA-3′）和BCR1-R（5′-CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC-3′）进行第一轮PCR 扩增，反应条件如下：96℃5 min，（96℃30 sec、58℃30 sec、72℃1 min）25 个循环，72℃10 min。以第一轮的PCR 产物1 μL 作为模板，以内引物recA-MF（5′-ATGACCGCCGAGAAGAG-3′）和recA-MR（5′-TGGAGACGACCTGGATAT-3′）进行染料法荧光定量PCR，反应条件如下：95℃5 min，（95℃15 sec、60℃32 sec）40 个循环。

1.4 菌种的生化鉴定

采用Vitek-2 Compact 全自动细菌鉴定仪（法国生物梅里埃公司生产）和配套的革兰氏阴性菌（Gram-negative，GN）鉴定卡进行临床标本的菌种生化鉴定，按仪器的操作手册进行。

1.5 统计分析

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，应用χ2检验比较分析两种检测方法的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巢式定量PCR 的特异性

为了提高检测的特异性，本研究首先针对recA基因设计外引物进行首轮扩增，然后以此产物为模板，利用内引物进行荧光定量PCR。结果表明，只有洋葱伯克霍尔德菌的标准株（B.cepaciaATCC 25416）有扩增曲线，而其他参考菌株均没有明显的扩增曲线（图1）。这说明，本方法可以特异检测洋葱伯克霍尔德菌，而对其他菌株呈阴性反应。

图1 不同菌株进行巢式定量PCR 的扩增曲线Figure1 Amplification curves of nested quantitative PCR for different bacterial strains

2.2 巢式定量PCR 的灵敏度

对洋葱伯克霍尔德菌进行计数，计算出菌液浓度后进行梯度稀释：1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100CFU/mL。对上述梯度菌液进行巢式定量PCR 检测发现，除了浓度1×100CFU/mL 外，上述其他浓度的菌液均有良好的扩增曲线，低至1×101CFU/mL 的菌液仍能被检测出（图2）。进一步提取洋葱伯克霍尔德菌的基因组DNA 进行定量，按所得浓度进行梯度稀释：1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6ng/μL。各取1 μL 进行检测发现，除了1×10-6ng/μL 的菌液外，低至1×10-5ng/μL 的菌液仍然有良好的扩增曲线（图3）。

图2 不同浓度洋葱伯克霍尔德菌进行巢式定量PCR 的扩增曲线Figure2 Amplification curves of Burkholderia cepacia with different concentrations by nested quantitative PCR

图3 洋葱伯克霍尔德菌不同浓度基因组DNA 进行巢式定量PCR 的扩增曲线Figure3 Amplification curves of Burkholderia cepacia genomic DNA in different concentrations by nested quantitative PCR

2.3 巢式定量PCR 对临床标本的检测结果

收集35例囊性纤维化患者痰标本分别用巢式定量PCR 和Vitek 2 Compact 仪器进行鉴定。检测结果发现，Vitek 2 Compact 仪器鉴定出10例标本有洋葱伯克霍尔德菌感染，有4例标本未检出，其余为其他细菌感染。而用巢式定量PCR 检测表明，与Vitek 2 Compact 仪器鉴定结果相比，其他细菌感染的标本无信号，但检测出洋葱伯克霍尔德菌感染的标本共14例，含Vitek 2 Compact 仪器无法检测的4例标本。巢式定量PCR 比Vitek 2 Compact 仪器对洋葱伯克霍尔德菌感染的检出率更高，但差异无统计学意义（χ2=0.560，P=0.454）。

3 讨论

近年来的临床检测发现，洋葱伯克霍尔德菌已成为人类感染的主要致病菌，已在多种疾病中被检测到，能加重疾病的进展［1］。因而，建立一种快速有效的临床检测方法能有利于疾病的及时治疗，减轻疾病向重症发展。

对于细菌的鉴定，目前已有成熟的方法，就是针对16S rRNA 进行特异扩增或序列测定，是细菌鉴定的金标准［8］。但16S rRNA 的序列在Bcc 菌种间的同源性高达98%～100%，从而无法将Bcc 鉴别到种［8］。近年来对洋葱伯克霍尔德菌的序列分析表明，其recA基因序列能有效区分Bcc 群内菌种［8-10］。因此，目前针对recA基因而展开的检测方法已有一定的进展。例如，周江林等［8］根据recA基因全长序列而进行的菌株全基因组平均核酸一致性值比较能有效纠正Bcc 复合群细菌的种鉴定信息。比较recA标准序列比对法和多位点序列分型技术对Bcc 种别鉴定的效果发现，两种方法的一致性为98.9%，但recA标准序列比对法具有更高的灵敏度（98.9%），且特异度达到100%，因而认为recA标准序列比对法更适合于医院感染流行病学调查和临床筛检［11］。余萌等［12］也认为，recA序列同源性分析可将药品中污染的Bcc 菌有效鉴别到种水平。本研究根据recA基因序列设计引物进行检测发现，本方法具有良好的特异性，只针对洋葱伯克霍尔德菌有扩增信号，而对其他菌属无扩增信号。因此，根据recA基因进行洋葱伯克霍尔德菌鉴定检测具有理论可行性和实际应用意义。

目前对于洋葱伯克霍尔德菌的鉴定检测已发展出多种方法，且不断在改进中。例如，根据伯克霍尔德菌属的gyrB基因设计引物，扩增测序后进行聚类比对分析发现，此方法可满足“种”水平的鉴定［13］。针对另一个特异基因hisA的研究也指出，所扩增的442 bp 的hisA-DNA 片段进行测序后，构建系统发育树表明hisA区可以区分所有Bcc 物种，说明该基因片段可用于Bcc 菌株的鉴定［14］。孙谦等［15］利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的方法可将洋葱伯克霍尔德菌群快速准确的鉴定至基因型。但Furlan 等［16］比较了不同的鉴定方法发现，表型鉴定不适用于Bcc 病原体的鉴定，VITEK 2 和MALDI-TOF MS 只能鉴定到不同的细菌属，16S rRNA 测序和recA基因PCR 扩增能鉴定到Bcc 菌群，且recA基因PCR 扩增具有更高的特异性。Lambiase 等［17］也认为，MALDI-TOF MS 对于Bcc 的鉴定具有一定的局限性。Zakharova 等［18］建立了一种基于检测单个β-内酰胺酶基因集的多重PCR 方法，能用于类鼻疽伯克霍尔德菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌、泰国伯克霍尔德菌和Bcc 的一步鉴定和分类；两对针对一类独特的金属β-内酰胺酶基因的特异性引物和一对针对苯唑西林水解D 类β-内酰胺酶基因特异性引物可成功区分Bcc 内的物种。上述有些方法准确度较高，但仍存在一定的缺点，不够快速、直接和灵敏。

鉴于荧光定量PCR 的特异、灵敏和快速方便等特点，其已越来越多的应用于临床检测中。例如，傅琼瑶等［19］根据类鼻疽伯克霍尔德菌Ⅲ型分泌系统保守基因的序列设计特异引物和探针，采用实时荧光定量PCR 技术检测发现，此方法灵敏度可达到10 copies/μL，可检测出土壤标本中低浓度的类鼻疽伯克霍尔德菌。Jimenez 等［20］利用实时荧光定量PCR 检测16S rRNA 的表达可有效检测出药品中污染的低浓度洋葱伯克霍尔德菌，其最低检测浓度为10 fg/μL，相关系数为0.98。Wright 等［21］针对recA基因进行的实时定量PCR 也能有效检测出患者中的洋葱伯克霍尔德菌感染。本研究在上述的基础上，采用巢式荧光定量PCR的方法，进一步提高了洋葱伯克霍尔德菌感染的检出率，具有更好的检测应用价值。

本研究表明，巢式荧光定量PCR 是一种可靠的方法，可直接用于临床洋葱伯克霍尔德菌感染的快速检测，从而为疾病的及时和准确治疗提供极大的便利性。