河南一起2型猪链球菌病的诊断与治疗

朱文豪，王治方，张青娴，许峰，方剑玉，徐引弟,李海利，王克领，焦文强

(1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002)

猪链球菌病是由猪链球菌引起的一类急性、热性传染性疾病，属于国家规定的二类动物传染病，临床上主要引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎等病症，是世界范围内养猪业最常见的细菌性疾病之一[1]。

近年来，随着我国养猪业集约化、规模化的发展，猪链球菌病的发生呈现上升趋势，同时，在发病过程中主要继发猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病等病，不单一发病，给猪场疾病诊断带来困难，给养猪业带来巨大经济损失。猪链球菌血清型比较多，有29个血清型，其中猪链球菌2型是毒力最强、流行最广的毒株。本试验通过对河南省豫东某规模化猪场疑似猪链球菌病发病采集相关病料，通过实验室PCR诊断，鉴定为2型猪链球菌，为2型猪链球菌的诊断与治疗提供参考依据。

1 材料

1.1 病料

2019年5月河南省豫东某规模化猪场发生疾病，症状为育肥猪只呼吸困难、关节肿大，还有部分猪只出现神经症状。剖检采集病猪关节液、脑、肺脏、淋巴结和血液等病料。

1.2 主要试剂

购自美国Difco公司的胰蛋白大豆琼脂(TSA)和胰蛋白大豆肉汤(TSB)；购自郑州益康生物工程有限公司的新生牛血清；购自珠海贝索生物技术有限公司的革兰氏染液试剂盒；抗生素药敏纸片和微生物微量生化鉴定管均购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA提取试剂盒以及PCR相关试剂均购自宝生物(大连)工程有限公司；相关引物以及测序实验均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 方法

2.1 病原分离纯化

将无菌采集的肺脏、脑、血液和关节液等病料分别划线接种于TSA平板(含5%的新生牛血清)，放置于37℃培养箱培养18～24h，观察菌落生长情况，挑选可疑菌落进行分离纯化、革兰氏染色镜检。

2.2 PCR检测、血清型鉴定

2.2.1引物设计

通过参照文献[2-4]设计合成猪链球菌通用引物和33种血清型引物(见表1)，通过聚合酶链式反应(PCR)将分离纯化的可疑菌株进行鉴定和血清型分型鉴定。

表1 猪链球菌PCR分型引物序列及相关信息

续表1

2.2.2PCR鉴定

按照DNA提取试剂盒说明书提取菌体DNA：取上述TSB液体培养物1mL于1.5mL离心管中，10000r/min离心5min后，弃上清收集沉淀；将收集到的沉淀物作为可疑菌落的DNA模板，进行PCR扩增鉴定。

PCR反应体系(50μL)：2×Taq Master Mix 26μL,上下游引物各2μL，ddH2O 16μL，模板DNA 4 μL。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃ 5min；4℃保存。

电泳：取10μL PCR扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳。阳性PCR扩增产物进行测序，将测序结果进行BLAST软件比对。

2.3 药物敏感性试验

参照其他文献进行药敏试验，采用琼脂扩散法(K-B法)[5-7]。在无菌操作下，将分离纯化后的TSA平板单个菌落挑选出来若干个，用0.9%灭菌生理盐水制成浓度为0.5麦氏单位(比色仪比色)的菌悬液，取200μL菌悬液用灭菌棉拭子均匀涂抹于TSA平板(含5%的新生牛血清)上，涂抹制作4个平板。使用临床常用的抗生素药敏片，均匀贴在上述4个平板上，在37℃培养箱中培养24h，取出观察，记录药敏片抑菌圈直径，判断标准参照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005版。

3 结果

3.1 细菌分离培养纯化

在接种脑组织病料的TSA平板(含5%的新生牛血清)上，发现有表面光滑湿润、圆形、边缘整齐的半透明、略带有蓝色光泽的小菌落。挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检，结果为革兰氏阳性，视野内可见菌体呈球形或卵圆形，单个、成对、短链或者长链状存在(见图1)。

图1 猪链球菌菌体形态(1 000×)

3.2 菌株鉴定和血清型检测

用猪链球菌通用引物对分离纯化菌株进行PCR鉴定，结果在500～750出现目的条带689bp(图2)，与标准条带片段一致。

M.DL 2 000 DNA Marker；1.阳性对照；2.阴性对照；3.分离菌株。

用33对猪链球菌血清型引物对分离菌株进行血清型分型鉴定，结果猪链球菌2型引物扩增阳性，出现557bp的目的条带(图3、图4)。测序结果与猪链球菌LSM102株(GenBank No.: CP016175.1)对比显示99%同源，表明所分离菌株为血清型2型猪链球菌。

M.DL 2 000 DNA Marker；1.血清型1/2型；2～32.血清型1～31；33.血清型33型。

M.DL 2000 DNA Marker；1.阳性对照；2.阴性对照；3.分离菌株。

3.3 药敏结果

采用常用5类18种抗生素对分离纯化的该株链球菌菌株进行药物敏感性试验，结果见表2。药敏结果显示，该株链球菌对β内酰胺类(头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林、青霉素、氨苄西林)、喹诺酮类(氧氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星)和磺胺类(复方新诺明)敏感；对氨基糖苷类(卡那霉素、阿米卡星)、四环素类(强力霉素、四环素、土霉素)和大环内酯类(阿奇霉素、替米考星)耐药。

表2 药敏试验结果 单位：mm

4 治疗

通过药敏试验结果，使用敏感性药物进行治疗，用复方新诺明肌肉注射，同时用阿莫西林拌料饲喂，连用7d。该猪场疫情得到有效控制，发病猪只好转，不再有健康猪只发病，猪场稳定下来。

5 讨论

众所周知，猪链球菌病在养猪业存在很久，是猪病中最常见的细菌性疾病之一，在临床上经常单独发生或者作为病毒病发病的继发病症发生，给养猪业造成不小的经济损失。猪链球菌血清型较多，其中血清型1型、2型、7型、9型公认致病性较强[2,8]。猪链球菌病在临床主要表现为关节炎型、败血症型、脑膜炎型三种，因此在治疗上，可以根据不同的表现症状使用敏感性药物对症治疗。

在本试验中是从脑组织病料中分离出一株猪链球菌，通过PCR血清型分型鉴定以及测序比对，证实得到的该菌株为2型猪链球菌菌株。再通过体外药敏试验结果表明，该株2型猪链球菌对β内酰胺类、喹诺酮类和磺胺类药物敏感；而对氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类药物耐药。这个结果与国内的有关研究报道[9,10]有一定不同，这可能与不同地区兽医工作人员用药习惯不同有关。

同时，链球菌病是一种危害性很大的人畜共患病，在疾病防控上兽医工作者不可掉以轻心。猪链球菌病的发生是一种对养猪业危害极大的传染性疾病，该病近年来在国内一直不断发生，给养猪业造成了严重的经济损失。在养殖过程中猪场应采取综合防治措施，严格科学管理；搞好猪舍环境卫生，确保猪场养殖安全；交替使用消毒药品，防止耐药性菌株的产生；严格无害化处理病死猪，以免带菌、散菌现象发生，从而减少该病的发生与致死，促进生猪养殖业健康、持续发展。