基于生物信息学分析P-Rex1在胃癌组织中的表达及临床意义①

张 刚 杜 娟 刘 敏 余 琼 夏伶俐 (江汉大学附属医院武汉市第六医院消化内科，武汉 430015)

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，其具有恶性程度高、转移性高等特点，近年来，胃癌发病率持续升高，与食品安全、毒物暴露和不良生活习惯等存在密切的联系[1]。目前胃癌的治疗手段相对较少，同时由于胃癌的早期诊断不完善，因此胃癌患者大多发现于中晚期，因此治疗效果不理想，5年生存期相对较低，患者生活品质显著下降[2,3]。因此探索新的与胃癌发生发展密切相关的基因，对于开发新的胃癌靶向药物具有非常大的意义。

3,4,5-三磷酸肌醇依赖的Rac交换因子1(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1,P-Rex1)最初在中性粒细胞中被发现并分离纯化出来，可以调节Rac的活性，在细胞增殖、骨架结构、细胞间交互作用中发挥重要的功能[4]。Dillon等[5]发现P-Rex1能够通过激活AKT/ERK信号通路促进乳腺癌的发展。P-Rex1被报道能够通过影响成黑色素纤维细胞的迁移参与黑色素瘤的转移过程[6]。也有一些研究表明P-Rex1能够通过活化Rac1促进前列腺癌的疾病进程[7]。然而在胃癌中关于P-Rex1的功能未见相关的报道。本研究从胃癌肿瘤标本出发，分析P-Rex1在胃癌中的表达，结合临床病理特征分析P-Rex1与预后的关系，并利用生物信息学的方法分析P-Rex1在胃癌中可能的信号调节网络。

1 资料与方法

1.1Oncomine数据库分析 Oncomine数据平台提供了多种肿瘤基因芯片数据(https://www.oncomine.org)，覆盖了七百多个独立数据库和高质量的专业数据分析方法。数据分析时，analysis type 设置为cancer vs.normal，dataset type选择TCGA datasets，cancer type选择gastric cancer，调取P-Rex1基因的mRNA表达数据。

1.2UALCAN数据库分析 采用UALCAN数据库中TCGA胃癌数据，根据不同的Tumor stage和Tumor grade，分析P-Rex1基因在不同胃癌分期中的表达变化。并把胃癌患者中按照有无幽门螺旋感染进行分组，发现其中有20例幽门螺旋杆菌感染患者，157例未罹患幽门螺旋杆菌感染，并分析P-Rex1基因mRNA水平的表达差异。

1.3Kaplan-Meier Plotter工具分析生存期 运用Kaplan-Meier工具(http://kmplot.com/analysis/)分析胃癌基于mRNA水平的基因芯片数据，筛选P-Rex1基因，高表达P-Rex1组胃癌患者和低表达P-Rex1胃癌患者的分组根据P-Rex1基因表达水平的中位数来进行，采用自动选择的截断值(auto select best cutoff)分析P-Rex1表达高低与胃癌患者总生存期(overall survival，OS)和进展后生存期(post progression survival，PPS)的关系。根据HER2把胃癌患者分为HER2阳性组和HER2阴性组；根据患者是否出现淋巴结转移，分为淋巴结转移阳性组和淋巴结转移阴性组。

1.4cBioPortal肿瘤数据分析 cBioPortal数据库中胃癌数据库，选择Stomach Adenocarcinoma(TCGA,PanCancer Atlas)，分析其mRNA表达(基于标准化的illuminaHiseq-RNASeqV2分析)，筛选到434例胃癌肿瘤标本，分析P-Rex1基因的表达，调取P-Rex1共表达(Co-expression)相关基因，选择前3 000个基因进行GO聚类分析，阐述P-Rex1在胃癌中可能的信号调节网路。

1.5STRING蛋白相互作用预测 基于cBioPortal筛选到的P-Rex1相关基因，结合STRING数据库(https://string-db.org/)分析P-Rex1的蛋白相互网络，并且基于关键蛋白节点进行GO分析，包括生物过程分析(biological process)、分子功能分析(molecu-lar function)和细胞组分分析(cellular component)。

2 结果

2.1P-Rex1在胃癌肿瘤组织中高表达 分析TCGA数据库中收集的415例胃癌肿瘤组织和34例癌旁组织，分析P-Rex1基因的mRNA水平，发现P-Rex1表达在胃癌肿瘤组织中显著高于癌旁组织中的表达(图1A)，差异具有统计学意义(P<0.000 1)。而进一步把胃癌患者按照不同的Tumor Stage进行分组，发现胃癌Ⅰ期患者的P-Rex1基因表达水平显著低于胃癌Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，而且169例胃癌Ⅲ期患者的P-Rex1基因表达水平高于123例胃癌Ⅱ期患者(图1B)，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。

2.2P-Rex1与肿瘤分期存在正相关的联系 如图2A所示，按肿瘤分期不同将胃癌患者进行分组比较，肿瘤Ⅰ期的胃癌患者中P-Rex1的mRNA表达低于肿瘤Ⅱ、Ⅲ期患者，而且246例的肿瘤Ⅲ期患者中P-Rex1的表达显著高于148例肿瘤Ⅱ期患者，数据统计量较大，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。而图2B按照是否感染幽门螺旋杆菌将患者分组，感染组患者和未感染组患者中P-Rex1的表达无统计学意义(P>0.05)。

2.3P-Rex1表达与胃癌患者预后密切相关 从胃癌患者总生存期(overall survival，OS)和发生疾病进展后生存期(post progression survival,PPS)两个层面分析P-Rex1表达与患者预后的关系。从图3A所示，P-Rex1高表达组的总生存期显著低于低表达P-Rex1胃癌患者，差异具有统计学意义(P<0.01，HR=1.4)；而进展后生存期曲线表明低表达P-Rex1的胃癌患者其生存期显著高于高表达P-Rex1的患者(P<0.001，HR=1.82)，说明了P-Rex1可以作为一个良好的胃癌预后诊断标志物。

2.4P-Rex1与临床病理特征的联系 如图4所示，根据胃癌患者HER2阳性阴性情况，分析HER2阴性胃癌患者中P-Rex1表达与总生存期的联系，发现HER阴性患者中P-Rex1高表达，则总生存期更短，差异具有统计学意义(P<0.01)；而HER阳性患者中P-Rex1高表达和低表达患者的总生存期无统计学意义(P>0.05)。而根据淋巴结转移与否，分析发现伴有淋巴结转移的胃癌患者，P-Rex1高表达患者较低表达患者生存期更短，差异具有统计学意义(P<0.01)，而无淋巴结转移的胃癌患者，P-Rex1高表达组和低表达组患者的生存期无统计学意义(P>0.05)。

2.5P-Rex1相互作用蛋白网络 根据cBioPortal数据分析TCGA胃癌数据库中P-Rex1及其共表达基因，结合STRING数据库，构建P-Rex1相互作用蛋白网络，如图5所示，与P-Rex1紧密相关的蛋白有Rac1、Rac2、Rac3、RhoA、RhoG、RhoU、RhoH、RhoBTB1、RhoBTB2和CDC42。

图1 P-Rex1在胃癌肿瘤组织中高表达Fig.1 P-Rex1 was overexpressed in gastric cancer tissuesNote: A.Expression of P-Rex1 was measured in tumor tissues and surrounding normal tissues；B.Expression of P-Rex1 was tested according to the different tumor stage of gastric cancer patients.

图2 P-Rex1表达与胃癌肿瘤分期存在正相关的联系Fig.2 Expression of P-Rex1 was positively correlated with tumor grade of gastric cancerNote: A.Expression of P-Rex1 was analyzed in different tumor grade of gastric cancer patients；B.Expression of P-Rex1 was measured in gastric cancer patients with H.pylori infection or not.

2.6P-Rex1共表达和相互作用蛋白网络GO分析 基于P-Rex1共表达和相互作用蛋白网络的构建，进行GO聚类分析，如表1所示，分析P-Rex1相互作用蛋白网络的biological process，发现P-Rex1与GTPase介导的信号通路、actin细胞骨架构建、细胞黏附功能、分化过程中细胞形态的调控、Rac信号转导、Ras信号转导等过程。而进一步的分子功能GO分析如表2所示，P-Rex1参与的分子功能主要有GTP活性调节，包括GTPase酶活性、GTP binding活性、阴离子binding活性、Rho GTP-se、Ras GTPase以及其他一些激酶的调节过程。

图3 P-Rex1表达与胃癌患者预后密切相关Fig.3 P-Rex1 expression was closely associated with prognosis of gastric cancer patientsNote: A.Overall survival rate was assessed with TCGA gastric cancer patients；B.Post progression survival rate was analyzed with TCGA gastric cancer patients,the high expression and low expression was determined with the auto best cutoff.

图4 P-Rex1与临床病理特征的联系Fig.4 Correlation between P-Rex1 and clinicopatho-logic featuresNote: A，B.Overall survival between P-Rex1 high expression and low expression was assessed in gastric cancer patients with HER2 positive or not；C，D.Overall survival between P-Rex1 high expression and low expression was assessed in gastric cancer patients with lymph node metastasis or not.

图5 P-Rex1相互作用蛋白网络Fig.5 Network of interaction protein with P-Rex1

表1 P-Rex1共表达及相互作用蛋白网络的GO-biological process分析

Tab.1 Go-biological process of P-Rex1 co-expression and interacting protein network

Term-IDTerm descriptionFalse RateGO:0051056Regulation of small GTPase mediatedsignal transduction1.81E-17GO:0007264Small GTPase mediated signal transduction4.68E-16GO:0035556Intracellular signal transduction2.13E-10GO:0030036Actin cytoskeleton organization1.37E-09GO:0010810Regulation of cell-substrate adhesion5.33E-08GO:1900026Positive regulation of substrate adhesion-dependent cell spreading3.26E-07GO:0010770Positive regulation of cell morphogenesisinvolved in differentiation5.77E-07GO:0007015Actin filament organization3.06E-06GO:0022604Regulation of cell morphogenesis3.19E-06GO:0010592Positive regulation of lamellipodium as-sembly8.78E-06GO:0016601Rac protein signal transduction1.03E-05GO:0120035Regulation of plasma membrane bounded cellprojection organization1.42E-05GO:0045785Positive regulation of cell adhesion3.50E-05GO:0007265Ras protein signal transduction3.85E-05

表2 P-Rex1共表达及相互作用蛋白网络的GO-molecular function分析

Tab.2 GO-molecular function of P-Rex1 co-expression and interacting protein network

Term-IDTerm descriptionFalse RateGO:0003924GTPase activity4.31E-16GO:0005525GTP binding2.69E-15GO:0043168Anion binding2.19E-09GO:0051022Rho GDP-dissociation inhibitor binding9.80E-06GO:0031996Thioesterase binding6.53E-05GO:0017016Ras GTPase binding0.0069GO:0017048Rho GTPase binding0.0094GO:0019207Kinase regulator activity0.0145GO:0030695GTPase regulator activity0.0283GO:0030234Enzyme regulator activity0.0366

图6 P-Rex1共表达网络进行GO聚类分析Fig.6 GO analysis of P-Rex1 co-expression protein based on cBioPortal

2.7P-Rex1共表达基因GO分析 基于cBioPortal分析P-Rex1在胃癌肿瘤组织中共表达网络，取相关性最强的前3 000个基因进行GO聚类分析，如图6所示，P-Rex1可能参与的细胞内生理活动包括淋巴细胞的激活、细胞因子的释放、免疫炎症反应、淋巴细胞的迁移和黏附、细胞内钙离子的调节等。

3 讨论

胃癌的发病率和死亡率近年来持续上升，而目前临床上胃癌的治疗主要依赖于手术、化疗和靶向治疗，而靶向治疗因肿瘤特异性的靶向相对于手术和放化疗，其副作用较小[8]。针对胃癌的靶向治疗靶标主要是EGFR和VEGFR等靶点，而目前越来越多的研究证实胃癌患者中存在EGFR和VEGFR突变，从而造成靶向治疗的失败[9,10]。因此开发针对胃癌治疗的新靶点具有重点意义。

本研究中发现P-Rex1在胃癌肿瘤组织中显著升高，并且其表达水平与胃癌患者分期以及肿瘤分期存在紧密的联系，考虑到幽门螺旋杆菌是胃癌发生最重要的影响因素之一[11-13]，进一步分析了幽门螺旋杆菌阳性胃癌患者和阴性胃癌患者中P-Rex1的表达差异，发现P-Rex1与幽门螺旋杆菌感染无显著的相关性。P-Rex1在胃癌中高表达，进一步分析其临床意义，发现P-Rex1高表达表现出胃癌患者的总生存期和进展后生存期降低的特点，而结合胃癌的分子特点和临床特点，进一步分析P-Rex1与HER2以及淋巴结转移的特点，发现HER2阴性患者中P-Rex1高表达，则总生存期更短，而HER2阳性患者中P-Rex1高表达和低表达患者的总生存期无显著差异；而伴有淋巴结转移的胃癌患者，P-Rex1高表达患者较低表达患者生存期更短，而无淋巴结转移的胃癌患者，P-Rex1高表达组和低表达组患者的生存期无显著差异，这表明P-Rex1可以作为伴有淋巴结转移的HER2阴性胃癌患者良好的预后分子诊断标志物，而胃癌诊断预后分子标志物的筛选在胃癌的治疗过程中具有丰富的临床价值，而P-Rex1作为预后分子诊断标志物具有一定的应用前景。

同时，依靠生物信息学和基因组学数据库，分析P-Rex1共表达和相互作用蛋白网络，并进行聚类分析，发现P-Rex1与小GTPase介导的信号通路、actin细胞骨架构建、细胞黏附功能、分化过程中细胞形态的调控、Rac信号转导、Ras信号转导等过程密切相关，并且可能参与淋巴细胞的激活、细胞因子的释放、免疫炎症反应、淋巴细胞的迁移和黏附、细胞内钙离子的调节等过程。而目前也有大量的报道说明了炎症免疫调节失衡在胃癌中的作用[14]，这与本研究的结论是一致的，然而免疫治疗在胃癌临床治疗中的潜在应用价值，值得进一步深入研究。