人星状病毒核酸检测方法的建立及应用

桑筱筱，操燕明，杨艾玲，王敬，杜松云

（武汉华夏理工学院，湖北武汉 430223）

人星状病毒（human astrovirus，HAstV）是导致婴幼儿、老年人以及免疫功能缺陷者腹泻的重要病原体之一[1-2]。Madeley等人在1975年首次从腹泻婴儿粪便中分离得到球形、直径为28～35 nm、无包膜、电镜下表面结构呈星形且表面有5～6个星状突起的病毒颗粒，因此命名为星状病毒[3]。HAstV感染率仅次于轮状病毒和诺如病毒，检出率在2%～10%[4]。HAstV是无包膜单股正链RNA病毒，基因组全长约 7 kb，包含 3个开放读码框（ORFla、ORFlb、ORF2），其中ORFla和ORFlb编码非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白。根据ORF2的348 bp核苷酸片段差异可将人星状病毒划分HAstV 1～8基因型，与其血清型的划分是一致的[5-6]。人星状病毒起初在实验室的诊断主要利用电镜鉴定以及免疫学方法，但准确度不够，这些检测方法在一定程度上限制了为腹泻患者提供最佳的初始诊断和后续的治疗。因此，需要一种可靠、快速的诊断工具。实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）已经取代了病毒培养和血清学等不敏感和耗时的技术，用于诊断病毒性胃肠道疾病。目前，HAstV的诊断依赖于分子诊断，用RT-PCR方法检测病毒RNA。因此，开发一种经济有效的RT-qPCR方法，用于检测临床标本中的HAstV，这对优化临床管理至关重要，可以减少不必要的抗生素使用，并允许在适当情况下使用抗病毒药物。

1 材料和方法

1.1 临床标本

研究采用的高温灭活人星状病毒上清液来源于武汉大学病毒国家重点实验室，共计12份；对象为2018年12月—2019年6月就诊的腹泻感染患儿195例，均为急性肠胃炎感染患者。

1.2 病毒核酸的提取

提取试剂为德国Qiagen公司的QIAamp min Elute virus spin kit，根据试剂盒的说明书操作，用200 μL临床标本提取病毒核酸，用100 μL洗脱液洗脱，如24 h内未检测，放-80 ℃保存。

1.3 引物及探针设计

根据GenBank上公布的HAstV全基因组序列，选取基因组中比较保守的ORF2基因保守序列设计引物和探针，上游引物为5’-TCAACGTGTCCGTAA MATTGTCA-3’，下游引物为5’-TGCWGGTTTTGGTCC TGTG A-3’；探针为FAM-CAACTCAGGAAACARGMGB-BHQ-1。引物和探针合成由上海生工生物技术有限公司完成。

1.4 构建阳性质控品

PCR扩增HAstV ORF2基因，反应体系为25 μL，反应条件为42 ℃，30 min；95 ℃，5 min，95 ℃，3 min，60 ℃，1 min，共35个循环。扩增产物为88 bp。PCR产物回收后与pGEM-T载体进行连接，转化大肠杆菌，蓝白筛选后，获得重组阳性质粒pGEMT-ORF2。

1.5 建立标准曲线

计算出重组质粒pGEMT-ORF2初始拷贝数，10倍倍比稀释，分别稀释为1×106copies/L、1×105copies/L、1×104copies/L 以及1×103copies/L，实时RT-qPCR，获取标准曲线，进而确定线性范围。

1.6 准确度试验

对12份人星状病毒上清液进行准确度试验，测试扩增反应准确性。

1.7 特异性试验

分别取临床上可见的消化道病毒，如轮状病毒、诺如病毒、肠腺病毒、札如病毒、肠道病毒和致病性大肠杆菌，测试扩增反应特异性。

1.8 RT-qPCR扩增

利用RT-qPCR方法对收集到的195份临床标本进行检测。反应体系：10×Buffer（含Mg2＋）5.0 μL，dNTP Mix（每管 2.5 mmol）4.0 μL，上下游引物终浓度均为0.4 μmol/L，TaqMan探针0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶4.0 μL，M-MLV逆转录酶1.0 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，模板10 μL，加纯水至终体积50 μL。RT-qPCR反应条件为：42 ℃，30 min；95 ℃ ，3 min，95 ℃，10 s；60℃，3 min，共 40 个循环。

2 结果与分析

2.1 pGEMT-Easy-ORF2目的基因普通PCR检测结果

对pGEMT-Easy-ORF2进行扩增，凝胶电泳检测为单一条带，大小在130 bp左右，与对照条带127 bp相符（见图1），表明重组质粒pGEMT-Easy-ORF2构建成功。

图1 pGEMT-Easy-ORF2目的基因普通PCR检测结果

2.2 实时荧光定量PCR的标准曲线的建立

图2为人星状病毒灵敏度试验结果。当标准品浓度为1×106～1×103copies/L时，拷贝数与其对应的CT值之间呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.999，线性关系为y=-4.166x+39.37，可对未知浓度的HAstV进行定量。

2.3 实时荧光定量PCR的准确性试验结果

如图3所示，对来源于武汉大学病毒国家重点实验室的高温灭活的人星状病毒上清液，共计12份进行准确度试验，准确度达100%。

图2 人星状病毒灵敏度试验

图3 人星状病毒上清液准确性试验

2.4 实时荧光定量PCR的特异性试验结果

如图4所示，对HAstV和消化道病毒如轮状病毒、诺如病毒、肠腺病毒、札如病毒、肠道病毒、致病性大肠杆菌进行特异性检测，检验结果无交叉反应。

图4 特异性试验

2.5 RT-qPCR检测结果

如图5所示，应用RT-qPCR方法对195份临床样本进行检测，检测阳性标本15份，阳性率为7.7%。

3 讨论与结论

目前，研究HAstV的主要方法是传统PCR等技术[7-8]。上述方法存在操作复杂繁琐，特异性较差、灵敏度不高等缺点，大大限制了对人星状病毒检测的临床研究。为了实现对人星状病毒操作简易、时间快速、特异性高的检测，本论文建立了人星状病毒进RT-qPCR检测研究方法。选取人星状病毒ORF2基因保守片段设计引物和探针，对常见消化道病原体如轮状病毒、诺如病毒、肠腺病毒、札如病毒、肠道病毒、致病性大肠杆菌等进行特异性检测；对195份样本进行检测，15份样本阳性，阳性率占比7.7%，由于样本量较少，灵敏度还需进一步加以研究和证实。

图5 临床应用检测

综上所述，本研究成功建立了人星状病毒RT-qPCR检测技术手段，实现了对临床样本中人星状病毒的检测，具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，为人星状病毒感染的临床诊断提供了一个辅助方法。