紫锥菊与黄芪多糖对环磷酰胺致免疫功能低下小鼠的影响

刘喜雨 曹荣昌 陈富珍 黄建新

（大理农林职业技术学院 671003）

紫锥菊 (Echinacea)，又称 “金花菊”，属于菊科，是一种多年生植物，起源于北美东部，且在北美洲作为药用植物已有上百年的历史，最早用于治疗感冒及上呼吸道感染［1，2］。近几年，紫锥菊多糖 （Echinacea purpurea Polysaccharide，EPS）的应用已逐渐从临床治疗向动物生产方向转移，且大量体内与体外试验结果显示，紫锥菊多糖主要通过增强机体免疫力发挥抗炎、抗细菌和抗病毒等方面的功效。而近几年紫锥菊多糖已作为一种饲料添加剂应用在畜禽生产中[3]。

黄芪多糖 （Astragalus polysaccharin，APS）是中药黄芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、降低血糖、抗衰老、增强机体免疫功能等广泛的生物学功能[4，5]，将其作为饲料添加剂或疫病预防治疗药物能增强动物细胞生理代谢、提高细胞免疫应答水平、抑制或消灭病原微生物的繁殖、提高动物生长性能和免疫功能[6]。

紫锥菊与黄芪多糖提取物均具有抗菌、抗病毒、增强细胞免疫和体液免疫的作用。目前对于二者应用的研究很多，但就其不同剂量组合应用对小鼠免疫功能的影响研究较少。本试验通过将二者按不同剂量组合配伍，探讨其对环磷酰胺致小鼠免疫力低下时的影响，为后续研究提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

2018年10月30日申购65只4～6周龄雌性清洁级ICR小鼠，11月8日小鼠到货，共65只，均重约15g/只，购自上海斯莱克实验动物有限公司。饲喂适应1周后进行试验。

1.1.2 药品与试剂

（1）药品：紫锥菊颗粒， （规格：1g相当于原生药1.25g），购自山东齐鲁动物保健品公司；黄芪多糖粉 （芪黄素）， （生产批号：1709201，规格：1g相当于原生药1.25g），购自爱迪森 （北京）生物科技有限公司；环磷酰胺， （批号：13051025；有效期：2019.05.03，规格：0.2g/瓶），购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

（2）试剂：氯化钠 （10019318）、氯化钾 （10016318）、磷酸二氢钾 （XK13～201）、磷酸氢钠 （10020318）、葡萄糖（10007118），均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验分组及给药程序

选取60只雌性清洁级ICR小鼠称重，随机分成10组，按体重分为 19～20g， 20～21g， 21～22g， 22～23g， 23～24g， 24～25g，25～26g排列，然后按照S型取样，每组6只，各组小鼠平均体重差异不超过1g。对10组进行标记，空白对照组腹腔注射0.2ml/d PBS缓冲液，其他各组腹腔注射0.2ml 80mg/(kg·d)CTX供试液，连续给药3d。而后，空白对照组和阳性对照组连续5d灌胃等体积PBS缓冲液，其余8组小鼠连续5d分别灌胃高、中剂量的EPS、APS和EPS+APS不同剂量组合。小鼠分组及处理方式见表1。

1.2.2 供试液的制备

（1）CTX母液的制备

取一个1.5ml离心管 （采用小容量管称取是为了减少误差）称取CTX原粉0.12520g，在无菌室加入PBS缓冲液反复稀释转移至10ml离心管中，超声溶解均匀，用5ml注射器吸取5ml，去掉针头，套上过滤头 (以0.22μm过滤器过滤)，将药液注入50ml管中，同样方法把剩下5ml也过滤加入50ml管中；再加入PBS缓冲液15ml，定量至25ml.制成5mg/mlCTX药物母液。如表2所示。

表1 小鼠分组、给药剂量及处理方式

（2）CTX供试液的制备

取1根50ml离心管按下表先加入药物母液，再加PBS顺序，涡旋混匀，制备供试液28ml。如表3所示。

（3）药物供试液的制备

先配制好母液，再取10根10ml离心管，做好标记。按下表先统一加入药物母液，再加PBS顺序，涡旋混匀，制备供试液20ml。按照给药方案灌胃给药，每天1次，连用5d。如表4所示。

1.3 相关测定

末次灌胃后24h，取股动脉血分离血清，取脾脏制备单细胞悬液进行免疫指标检测。

1.3.1 血清中细胞因子含量测定

股动脉采血分离小鼠血清，按试剂盒说明书操作，采用ELISA法测定小鼠血清IL-2和TNF-α水平。

1.3.2 小鼠脾淋巴细胞增殖反应

表2 CTX母液的制备

表3 CTX供试液的制备

断颈处死小鼠，无菌条件下取小鼠的脾脏，加适量Hank's液研磨，绸布滤过，1500r/min离心5min，弃上清。涡旋细胞沉淀，加Hank's液重复洗涤2次。收集脾细胞，加适量RPMI 1640完全培养液混悬，以台盼蓝拒染法计数，活细胞数不少于95%，加RPMI 1640完全培养液稀释，并调整至所需的细胞浓度 （实际为细胞悬液倍比稀释，酶标仪测OD值，制备细胞数～OD值标曲进行计数）。于96孔微量板中，每孔加脾细胞悬液（7.5×106个/ml） 100μL， 每个脾细胞样品重复 12孔， 分别加Con A液 （终浓度为 5μg/ml）、 LPS液 （终浓度为 10μg/ml） 或RPMI 1640培养液至总体积为200μL，重复3孔。另设培养液空白对照组。37℃、5%CO2培养44h，各孔加MTT溶液 （2mg/ml）50μL，继续培养4h。1800r/min离心 5min，弃去各孔上清，分别加DMSO溶液150μL，于室温暗处以微量振荡仪振荡15min，以酶标仪于波长490nm处测定OD值，计算刺激指数（SI值）。

刺激指数 (Stimulatory index，SI)=加有丝分裂原培养物的OD值不加有丝分裂原培养物的OD值

1.3.3 NK细胞活性测定

取指数生长期的人红白血病K562细胞或小鼠淋巴瘤YAC-1细胞，加入RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为3×105cell/ml，作为靶细胞；取制备的1×107cell/ml的脾细胞悬液作为效应细胞。于96孔细胞培养板上，每孔加入效应细胞悬液100μL(1×106cell)，重复8孔。其中4个复孔每孔加入靶细胞悬液 100μL(3×104cell)作为实验孔 （效靶比 50：1）， 另外 4个复孔每孔加入RPMI-1640完全培养液100μL作为效应细胞对照。再设靶细胞对照组 （每孔加入靶细胞悬液100μL和RPIM-1640完全培养液100μL）和空白对照组 （即每孔加入RPIM 1640完全培养液200μL）。置于37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育 1h。每孔加入 MTT溶液 （2mg/ml）50μL，继续孵育 4h。1500rpm离心5min，弃去上清液，加入DMSO 150μL/well，于室温暗处以微量振荡仪振荡15min，以酶标仪于波长490nm处测定OD值，并计算NK细胞活性。

1.3.4 脾细胞上清中细胞因子含量测定 （ELISA）

于24孔细胞培养板中，取制备的脾细胞悬液，每孔加7.5×106cell/ml的脾细胞悬液1ml和刺激原稀释液 (ConA终浓度为4μg/ml)各1ml，置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养72h，2500rpm离心5min，收集细胞上清。根据小鼠细胞因子 （INF-γ、IL-10）ELISA检测试剂盒说明书，测定细胞因子含量。

1.3.5 血清免疫球蛋白测定

按试剂盒提供的ELISA法测定血清IgG、IgM和IgA水平，向酶标板内加入阴性对照、标准品或经稀释的待测血清样品100μL，做复孔。酶标板加上覆膜，水平放置，室温孵育60min。弃去液体，甩干，用洗涤液洗涤4次，甩干。每孔加酶标抗体100μL，加上覆膜，室温避光孵育30min。弃去液体，甩干，用洗涤液洗涤4次，甩干。每孔加TMB底物溶液100μL，室温避光孵育10min。依序每孔加终止溶液100μL，终止反应。用酶标仪在450nm波长处测定各孔的光密度值 (OD值)。

表5 小鼠平均体重指数

2 结果

2.1 体重指数

CTX造模3d后造模小鼠均出现体重明显下降，造模成功；连续5d灌胃不同剂量组合药液后得到，体重快速恢复增加的前3组分别是CTX阳性对照组、PBS空白组和EPS（中剂量1.25）与APS（高剂量3.75）组；体重恢复慢的后3组分别是EPS（高剂量2.5）与APS（高剂量3.75）组、EPS（中剂量1.75）组、APS（中剂量1.875）组。说明紫锥菊多糖与黄芪多糖不同剂量组合并没有明显增强小鼠的免疫调节机制。每组平均体重指数变化如表5所示。

2.2 脾脏指数

通过对脾脏进行脾细胞增殖的相关试验，得出脾脏指数如表6所示。

表6 每组小鼠脾脏指数统计

2.3 IgG、IgM含量测定结果

由图1、2可知，通过收集小鼠血清检测，模型组小鼠血清IgG、IgM抗体水平明显低于空白对照组，造模成功，但给药后效果不显著。

3 讨论

免疫增强剂是一类通过非特异途径提高机体对抗原的特异性反应的物质。有利于增强机体的免疫功能，缓解环境应激造成的免疫功能紊乱或下降，使人或动物健康生长。紫锥菊和黄芪现已成为国内外普遍应用的免疫增强类天然药物之一，普遍应用于临床治疗增强人或动物的免疫机能。

许多研究表明，紫锥菊富含挥发油、有机酸、多糖等多种活性成分，具有改善机体免疫功能，降低动物的发病率，从而提高动物的生长性能[6]。姚维平等[7]报道在断奶仔猪日粮中添加0.5%、1.0%、1.5%的紫锥菊复方可以显著改善断奶仔猪生长性能一致。梁华平等 （1994）[8]测定发现，烧伤后6d小鼠的脾脏指数和胸腺指数降低，腹腔注射250mg/kg体重黄芪多糖，每天1次，连续5d，不仅可以明显提高正常小鼠的脾脏指数和胸腺指数，还可使烧伤小鼠的脾脏指数和胸腺指数恢复正常。倪耀娣等[9]发现，紫锥可提高肉鸡对IBD疫苗的免疫力，并能显著改善和提高肉鸡的生产性能。其中最佳添加剂量为0.5%紫锥菊提取物单剂。在和黄芪配伍后，合剂 (0.5%+0.25%)、合剂 (1%+0.5%)剂量的免疫促进效果与0.5%紫锥菊提取物单剂一致。所以本次试验导致小鼠体重恢复较慢的原因可能是药物配伍剂量不足。

黄芪多糖能明显增加小鼠脾脏、胸腺重量，同时能对抗免疫抑制剂泼尼松龙或强的松龙所造成的对脾、胸腺、肠淋巴结等免疫器官的萎缩作用，也能对抗环磷酰胺引起的脾脏萎缩。毛晓峰等[10]发现，黄芪多糖能提高免疫应激后断奶仔猪的细胞免疫功能，降低炎性因子和应激激素的分泌，从而发挥抗免疫应激作用。张艳等[11]研究结果提示，APS对烧伤小鼠的免疫调节作用依赖于巨噬细胞，通过调节其分泌白细胞介素-1（IL-1），抑制前列腺素E2（PGE）合成，而促进IL-2产生及IL-2受体 （IL-2R）2表达，进而增强T淋巴细胞增殖。邱培勇等[12]研究发现，环磷酰胺对小鼠免疫功能有明显抑制作用，黄芪多糖不仅能有效抑制抗免疫，对正常小鼠也有免疫增强作用。颜培宇等[13]发现，APS能重建免疫功能低下小鼠机体正常的免疫功能，促进机体ThO向Thl的分化，维持Thl的优势状态，增强机体细胞免疫功能。王晓珊[14]报道了在鸡饲料中添加1.0%紫黄散能明显提高鸡的生长性能与免疫功能。不同畜禽因生理机能不同，药物剂量组合不同，通过试验设计出适合于各种畜禽标准的剂量组合，更好地服务于畜禽生产，是今后研究的一个重点课题。

4 结论

紫锥菊多糖与黄芪多糖均具有抗菌、抗病毒、增强细胞免疫和体液免疫的作用。而本次试验效果对小鼠生长性能、IgG、IgM与脾细胞增殖都不明显，可能是因为不同配伍给药疗程太短、剂量组合不理想及操作失误等原因，没能明显体现出紫锥菊多糖与黄芪多糖配伍对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。所以本次试验设计有待进一步完善，希望试验结果能对研究人员在进行深入研究时有所帮助。