牦牛卵丘细胞体外培养方法优化

李晶晶潘阳阳马睿韩小红张翠兰余四九*

（1，甘肃农业大学动物医学院甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心 730070；2，甘肃省永登县疫病预防控制中心 730300）

家畜的繁殖性状是其重要的经济性状，卵巢是雌性动物生殖的基础，卵泡是卵巢的基本功能单位，是卵子发生的微环境，当卵泡发育至有腔卵泡期卵丘细胞 （Cumulus cells，CCs）通过高度特异性的细胞质突起穿过透明带接近卵母细胞膜形成缝隙连接和细胞间桥等连接功能上的合胞体即卵丘卵母细胞复合体 （cumulus-oocyte complexs，COCs）[1]， CCs在卵母细胞周围特殊的结构组织有利于它们之间的持续相互作用。事实上，CCs为卵母细胞提供营养[2]如小分子物质丙酮酸、氨基酸、核糖核苷等；支持卵母细胞胞质成熟[3]，CCs维持卵母细胞减数分裂停滞[4]。因此，CCs可以用研究卵母细胞成熟机制研究；CCs也可作为核移植良好的供体细胞[5]；也可用于探讨某些因子或药物对卵巢的作用机制[6]。本研究以牦牛的卵巢为材料，采集其卵泡中的COCs，进行CCs分离原代改良培养，并对所得到的细胞进行传代培养，以改良牦牛CCs的体外培养方法，为牦牛的卵母细胞成熟、CCs生物学等方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牦牛卵巢取自西宁屠宰场。DMEM/F-12、胎牛血清 （Fetal Bovine Serum，FBS）购于Gibco公司；胰蛋白酶、透明质酸酶和DMSO等购自Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牦牛卵丘细胞原代改良培养

将牦牛卵巢放在加有抗生素、温度在35～37℃生理盐水的保温瓶中，并于4h内带回实验室。使用12号针头的10ml注射器从直径2～6 mm的卵泡中回收COCs[7]。在体视显微镜下收集胞浆均一和至少3层完整致密的卵丘细胞COCs，进行CCs的分离培养。随后，用0.1%透明质酸酶消化COCs，直到CCs与卵母细胞完全分离。体视显微镜下去除裸卵。CCs在1000r/min离心5min后，用磷酸盐缓冲液 （PBS）洗涤2次，调节细胞浓度为1×105/ml，原代细胞在含有15%和10%FBS的DMEM/F12培养基的细胞培养液中37℃，5%CO2培养。根据培养液颜色橘红色生长良好，黄色则需要换液，一般原代前期每两天换液一次，对数期开始每隔一天换液一次。

1.2.2 传代培养

原代细胞汇合至90%时弃去培养液，先加入PBS约2～3ml，轻轻晃动培养瓶，漂洗1～2次，用移液枪吸干PBS后加入胰蛋白酶消化液1ml，轻轻晃动培养皿使消化液没过整个细胞层，显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大，应立即吸弃消化液再根据细胞脱落情况选择适当干消化，当大片细胞开始脱落时迅速加入2ml完全培养液终止消化。将消化后的细胞混合液转移到离心管中，1000r/min离心3min，弃上清，再用PBS离心清洗2次，弃上清液在沉淀中加入完全培养液，调节细胞浓度为1×105/ml，细胞在10%FBS和1%青霉素/硫酸链霉素溶的含DMEM/F12培养基的细胞培养液中培养，37℃，5%CO2。待细胞生长汇合至90%左右进行传代或冻存。

1.2.3 牦牛卵丘细胞生长曲线

当两种原代培养的原代CCs汇合至90%时，分别用胰蛋白酶消化，密度为1×105的细胞悬液接种于24孔板0.5mL/孔37℃，5%CO2培养，接种细胞密度为第一天的细胞密度，之后每天在同一时间从24孔板用胰蛋白酶消化三孔细胞，用细胞计数板计数后计算出细胞密度，三孔求平均值为当天细胞密度。以培养天数 （d）为横坐标，以当天细胞密度 （×105个/ml）为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3 数据分析

所有验验至少重复3次，并使用SPSS对数据进行单因素方差分析实验数据。

2 结果

2.1 牦牛的卵丘细胞原代培养与传代

牦牛的CCs采用贴壁法进行培养。15%FBS培养的原代CCs（1×105个/ml）在接种到培养瓶或平皿中6～8h就有贴壁，12h后观察到有少量细胞已经贴壁生长，由圆形变成长梭形或不规则三角形，呈放射状排列。3d时大部分贴壁细胞末端相互接触，开始汇合，细胞形成丛生状，细胞之间有大片间隙。4～5d时细胞之间空隙减少，相连成片，并排列成有序的束状或带状。7～8d后细胞之间空隙消失，细胞排列紧密饱满而有规则，铺满培养瓶的底部 （见图1a）。15%FBS培养的原代细胞汇合成90%，即可进行传代 （1×105个/ml），细胞生长有规律，形态稳定多为梭形 （见图1b），培养过程中可视培养液的颜色1～3d换一次培养液。以上述方法传代可连续传至15代以上细胞形态稳定且不老化。而10%FBS培养的原代细胞形态形成细胞单层需要9～10d，细胞形态不稳定，出现不同生长区域，相对平铺不饱满 （见图1c），传代培养后细胞形态不均一 （见图1d）相同条件培养传至第7～8代开始老化。

2.2 牦牛卵丘细胞二代生长曲线

牦牛CCs生长曲线基本上呈 “S”型 （见图2～3）。15%FBS接种后，细胞经历2d的缓慢生长的潜伏期，第3天细胞开始迅速生长， 进入对数生长期， 到第7天细胞开始发生接触抑制，之后细胞生长缓慢， 进入平台期 （见图2）。10%FBS接种后，细胞经历3d的缓慢生长的潜伏期，第4天细胞开始进入对数生长期， 到第8天细胞开始发生接触抑制进入平台期 （见图 3）。

3 讨论

牦牛原代卵丘细胞 （1×105个/ml）接种后，随着贴壁生长形状由圆形变成长梭形或不规则三角形，呈放射状排列而不是长梭形或流线型，这与猪、牛的原代卵丘细胞形态一致[8，9]。但15%FBS培养细胞排列紧密饱满而有规则，铺满培养瓶的底部，可传至15代以上。10%FBS培养细胞相对平铺不饱满，成簇生长，传至7～8代就开始老化。相同培养条件观察二代培养细胞生长曲线可以看出，原代10%FBS培养的二代第4天进入对数生长期，对数期相对平缓，第7天进入平台期。而原代15%FBS第3天就进入对数期，对数期相对陡峭细胞活性较高，第7天进入平台期。这与牛颗粒细胞等生长曲线相似[9]，比猪卵丘细胞[8]进入平台期少1d，这可能与物种有关。另外要获得优质培养细胞还要注重细胞培养操作细节，在传代培养时注意把握消化时间，先湿消化再干消化可最大程度减少消化液对细胞的伤害，适时更换培养液，减少机械化学损伤和污染发生，最大限度保证良好的培养条件，来获得形态良好活性较高的卵丘细胞。

结果表明不同的原代培养条件可影响传代细胞生长规律和质量，牦牛卵丘细胞原代培养改良后，第二代细胞生长曲线“S”型，接种后，经历2d的潜伏期，第3d细胞开始迅速生长，进入对数生长期，细胞形态良好，到第7d细胞开始发生接触抑制，进入生长缓慢的平台期；细胞可传至15代以上不老化，可用于建立牦牛卵丘细胞株。稳定生长形态良好的牦牛卵丘细胞可用于牦牛卵丘细胞生物学研究，为牦牛卵母细胞成熟机制研究奠定基础。