粪便乳杆菌FZB1对Balb/cJ小鼠焦虑行为的影响*

高小洁, 苟秋凤, 苏森森, 姚 芳, 许晓羽, 谢拥军, 潘 渠

成都医学院 病原生物学教研室(成都 610500)

乳杆菌是存在于人体肠道中的重要益生菌，它们在维持人体肠道环境的微生态平衡和提高机体免疫力方面有着关键作用[1]。如植物乳杆菌06CC2可改善小鼠急性结肠炎[2]。罗伊乳杆菌可抵挡病原体感染[3]。约翰逊乳杆菌能减轻呼吸道病毒感染[4]。鼠李糖乳杆菌可减轻行为缺陷[5]。乳杆菌的肠外益生作用可能是通过调节脑-肠-微生物轴来调节免疫、神经内分泌和迷走神经通路[6]。这些发现说明了乳杆菌不仅在维持肠道微生物平衡中扮演重要角色，而且有助于宿主的心理健康。

焦虑行为通常是一种与压力有关的情绪障碍[7]。先前研究[8-10]已经发现了乳杆菌可以缓解宿主的焦虑，如植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。Kelly等[11]报道，鼠李糖乳杆菌不能改善健康男性的压力或认知表现。再者，Steenbergen等[12]发现嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌可减轻宿主的好斗倾向，但对减轻焦虑意义不大。以上两位的研究都没有检测菌株在肠道中的黏附定植情况，然而益生菌在肠道内的黏附定植可能是其产生心理效应的必备条件。

粪便乳杆菌(Lactobacillusfaecis)是2013年从南非豺狼和浣熊粪便中分离得到乳杆菌新种[13]。本研究中粪便乳杆菌FZB1(CGMCC 10515)是2010年从四川富顺县白鹭新鲜粪便中分离提取的，且已经进行了16 S rDNA、RNA聚合酶α亚基(rpoA)和重组酶A基因(recA)的测序和生化特性测定。

1 材料与方法

1.1 菌株

福菜乳杆菌YM0097从台湾生物资源收集与研究中心购买，粪便乳杆菌FZB1、植物乳杆菌PC518、E.coliE57储存于成都医学院微生物实验室。粪便乳杆菌FZB1、福菜乳杆菌YM0097、植物乳杆菌PC518在MRS液体培养基中37 ℃静置过夜，E.coliE57在LB培养基中37 ℃震荡过夜。所有菌体通过离心收集(8 000 r/min，离心半径6.5 cm，4 ℃，10 min)，然后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)重新悬浮并调整浓度至1.0×108CFU/mL(OD600nm=0.5)。

1.2 粪便跟踪

rpoA、recA具有保守性，其DNA序列具有物种特异性。本研究中对粪便乳杆菌FZB1的两个基因进行了测序，并将其序列上传GenBank，登录号为KP325479、KP325478。采用PCR技术，设计引物rpoA-F-5′-TGGTGTGATCGAACCGTTTG-3′，rpoA-R-5′-AGGGTCGAGGCTATGTTTCC-3′；recA-F-5′-TGGGACATCAAACGTGCTTG-3′，recA-R-5′-ATCGATGCGTTGCTCTTGTC-3′。

PCR扩增片段长度分别为194、188 bp。使用序列比对工具BLAST在GenBank数据库中比对扩增片段的测序结果。结果表明，两对引物均能特异性扩增粪便乳杆菌FZB1的recA和rpoA基因。为检测引物，以植物乳杆菌PC518、粪便乳杆菌FZB1和Balb/cJ小鼠粪便样品(有或无粪便乳杆菌FZB1)为模板，进行PCR。用本研究设计的引物进行PCR检测Balb/cJ小鼠粪便17 d。为制备PCR模板，粪便样品在100 ℃下加热3 min，11 200 r/min，离心半径6.5 cm，离心5 min，取上清液作为模板。PCR为20 μL体系，由2 μL的模板，3 μL引物，5 μL超纯水，10 μL的2×Taq Master Mix(Dye Plus)组成。PCR程序设置为：95 ℃预变性，5 min；94 ℃变性，40 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，45 s；共30个循环，最后72 ℃末端延伸5 min。每天随机抽取两份PCR样本送出测序，BLAST比对序列。

1.3 行为测试

1.3.1 动物 有研究[14]报道，焦虑行为可以通过RU24969(5-HT受体激动剂)诱导，而用5-HT受体抑制剂氟西汀可减轻焦虑。根据成都医学院实验动物研究委员会批准实行以下实验方案。Balb/cJ雄性小鼠(n=110，体重20～25 g，8～10 周龄)每笼22只，分饲喂或不饲喂粪便乳杆菌FZB1两组饲养。按Kantak等[14]方法分5组：1)生理盐水组；2)RU24969组；3)FZB1+RU24969组；4)氟西汀+RU24969组；5)FZB1+氟西汀+RU24969组。粪便乳杆菌FZB1和氟西汀灌胃剂量分别为1×107CFU/d和10 mg·kg-1·d-1，饲养4周。

1.3.2 焦虑行为诱导 采用10 mg/kg剂量的RU24969诱导焦虑行为。行为测试在腹腔注射60 min后进行。

1.3.3 Morris圆形水迷宫(morris water maze, MWM) 焦虑会影响学习和记忆的表现，可用MWM来评估学习和记忆能力。实验方案根据Jung等[15]进行了修改，水池深28 cm，加入100 mL墨水(24±2) ℃。第1天在没有设置平台的情况下进行90 s游泳训练。接下来4 d，小鼠每天接受4次平台就位实验。如果小鼠没有在90 s内游到平台，则将其在平台上停留10 s。最后将平台没于水下1 cm，水面上不可见，然后记录小鼠到达平台的时间。

1.3.4 高架十字迷宫(elevated plus maze, EPM) EPM通常用于测试焦虑行为。用Mark等[16]描述的EPM实验方法和步骤。EPM由一个“+”字交叉型支架组成，两臂封闭，两臂开放。臂长28.5 cm，离地面55.0 cm。将小鼠面向封闭臂放在EPM的中心。实时记录小鼠在开放和封闭的臂中停留时间。进入臂定义为小鼠80%的身体进入了臂。每次实验前用75%乙醇消毒EPM。以下数据通过计算获得：1)进臂总数；2)进入开放臂的小鼠百分比(100%×进入开放臂的小鼠/进臂总数)；3)小鼠在开放臂停留时间百分比(100%×小鼠在开放臂停留时间/进臂总时间)。

1.3.5 社交行为实验 (social interaction test, SIT) SIT是参考文献[17]进行。将1对饲喂相同食物的小鼠放入1个盒子里(50 cm×30 cm×30 cm)，安静环境，40 W红灯下，放置10 min。为了减少新环境不适，小鼠在进行实验前2 d被放置在测试盒子熟悉环境，2 次/d，5 min/次。电脑记录小鼠间接触次数和接触时间，包括跟随同伴、追赶同伴、嗅生殖器、打架、趴在小鼠身上以及头与头接触。

1.4 统计学方法

行为测试数据用自动追踪的摄像机记录。采用SPSS 13.0软件作统计数据分析，采用单因素方差分析判断组间差异，检验水准α除特殊说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 粪便追踪

用粪便乳杆菌FZB1和饲养粪便乳杆菌FZB1的Balb/cJ小鼠粪便为模板，用rpoA或recA引物对进行PCR，然后做凝胶电泳，分别扩增194 bp和188 bp条带，共进行了17 d实验，从第14天开始就不能扩增出194 bp和188 bp两个条带。用未饲养粪便乳杆菌FZB1的Balb/cJ小鼠粪便和植物乳杆菌PC518模板进行PCR，不能获得条带。测序结果证实，PCR获得的194 bp和188 bp片段分别代表粪便乳杆菌FZB1的rpoA和recA基因。这表明粪便乳杆菌FZB1在Babl/cJ小鼠肠道内黏附并定植了13 d。

2.2 MWM

注射RU24969后，与生理盐水组相比，小鼠在MWM中到达平台的时间延长，这表明成功建立了Balb/cJ小鼠的焦虑模型。与生理盐水+RU24969组相比，饲养粪便乳杆菌FZB1的小鼠到达平台时间明显缩短(P<0.05)；此外，FZB1+RU24969组改善程度低于氟西汀+RU24969组(P<0.05)；而FZB1+氟西汀+RU24969组的改善程度高于单独使用粪便乳杆菌FZB1或氟西汀组(P<0.05)(图1)。

2.3 EPM

EPM用来检测动物的探索行为。注入RU24969组的3个探索指标(进臂总数、进入开放臂的小鼠百分比和小鼠在开放臂停留时间百分比)低于生理盐水组。饲养粪便乳杆菌FZB1的小鼠与生理盐水+RU24969组相比，3个指标分别提高了166.6%、71.6%和66.9%(图 2)。

2.4 SIT

以小鼠互动的次数和时间作为社交技能的指标。注射RU24969后，两项指标均低于生理盐水组，而喂食粪便乳杆菌FZB1后，两项指标均较RU24969组明显提高，分别提高了77.9%和111.1%(图 3)。

图3 SIT

注：A：互动时间；B：互动次数；各组间比较，P<0.05

3 讨论

益生菌的益生作用取决于它们在胃肠道中的黏附和定植。本研究中通过PCR检测粪便样本，研究粪便乳杆菌FZB1在小鼠肠道中的黏附定植情况。Matsumoto等[18]报道双歧杆菌亚种LKM512在老年人肠道中定植7周，改善了老年人肠道微环境。在另一项研究中，Balzaretti等[19]报道了副干酪乳杆菌LPC-S01和DG菌株在健康志愿者肠道定植7 d。Selim等[20]报道，使用鸡粪便进行的实时PCR直到第27天检测到耐热乳杆菌，尽管含量相对低。Saito[21]对12名志愿者粪便进行了5 d的检测，只在1名志愿者粪便中检测到瑞士乳杆菌GCL1001。此外，Kelly等[11]报道，鼠李糖乳杆菌JB-1的心理益生作用对小鼠明显而对人不明显，这可能是因为该菌株能够在小鼠肠道中定植，而不能在人类肠道中定植有关。益生菌发挥益生作用可能需要肠道定植，且可能与定植时间呈正相关。因此，菌株在宿主中的定植时间对于证明益生菌的有效性是重要的。可通过PCR追踪益生菌在宿主肠道的定植情况。

不管记忆障碍是由氨苄青霉素还是东莨菪碱诱导的，发酵乳杆菌NS9[22]、植物乳杆菌C29、戊糖乳杆菌[15]和双歧杆菌、沙克乳杆菌I033[23]的二次发酵提取物已被证明在MWM中改善记忆障碍是有效的。EPM中，发酵乳杆菌NS9[22]、短双岐杆菌1205、植物乳杆菌PS128和瑞士乳杆菌NS8均能有效改善焦虑行为。使用SIT的研究结果表明，瑞士乳杆菌R0052、长双歧杆菌R0175[24]和鼠李糖乳杆菌JB-1[5]可改善抑郁或焦虑行为。在本研究中，MWM、EPM和SIT结果均显示，粪便乳杆菌FZB1可减轻小鼠焦虑行为，氟西汀和粪便乳杆菌FZB1对改善焦虑有协同作用。如果这些效果在人类临床试验中能得到证实，那么就有可能为患有焦虑症的人开发一种含有粪便乳杆菌FZB1制剂的联合药物。