多西他赛联合基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT对前列腺癌移植瘤生长的影响

潜 力 符翠莉 李锡明 黄桂海 林俊浩 李 伟

作者单位：530021 南宁 广西壮族自治区人民医院1药学部；2泌尿外科

我国前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，发病率由1988年的1.96/10万升至2015年的60.3/1 000［1-3］。传统内分泌治疗可暂时缓解中晚期患者症状，但几乎所有患者均不可避免要经历去势抵抗性前列腺癌阶段，以阿比特龙和恩扎卢胺为代表的新型内分泌药物虽然可在一定程度上延缓去势抵抗性前列腺癌进展，但总体疗效仍不理想［4-6］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是由结缔组织细胞分泌，依赖锌离子的内肽酶基因家族，可通过降解细胞外基质和基底膜促进肿瘤的侵袭和转移［7-8］，其重要成员MMP-2和MMP-9在前列腺癌骨转移中发挥了重要作用［9］。SB-3CT是MMP-2和MMP-9强有力的抑制剂，目前研究显示SB-3CT可通过降低瘤体内血管密度和骨质降解从而抑制前列腺癌骨转移瘤［10］。以多西他赛为基础的化疗是治疗去势抵抗性前列腺癌的首选方案，但多西他赛单药并不能有效控制疾病进展［11］。本团队前期研究显示，基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT联合多西他赛对体外培养的前列腺癌PC-3细胞生长具有显著的抑制作用［12］，为进一步证实基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT联合多西他赛的联合用药疗效，本研究在此基础上建立了人PC-3前列腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，观察其对裸鼠移植瘤生长的影响，并初步探索潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

人前列腺癌细胞PC-3购于上海中国科学院细胞库，细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基中，2～3 d换液1次，细胞80%融合度达80%时传代，置于37℃，5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养。SPF级Balb/c Nude小鼠15只购于重庆腾鑫生物技术有限公司，4～6周龄，20～25 g，雄性。饲养于SPF室超净层流架内，动物房12 h-12 h昼夜交替，自由饮水、进食，温度23～25℃，适应性喂养1周后进入实验。RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；SB-3CT、多西他赛购自美国Sigma公司；兔抗人PDK1单克隆抗体、兔抗人PFKFB4单克隆抗体和HRP的二抗均购自美国Abcam公司；倒置显微镜购自日本Nikon公司。动物实验符合伦理要求。

1.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立及分组

取对数生长期的PC-3细胞制成浓度为6×107/mL的细胞悬液，并于裸鼠右腋部位皮下接种150 μL。皮下接种1周后观察成瘤情况及裸鼠生长状况，待长出肿瘤后，每隔2 d用游标卡尺测量肿瘤长径、短径并计算肿瘤体积（肿瘤体积=长径×短径2/2），绘制肿瘤生长曲线。待移植瘤体积达100mm3时按不同分组进行处理，实验分为3组：SB-3CT组裸鼠5只，瘤体注射SB-3CT溶液25 mg/kg，每周3次，连续4周；联合用药组裸鼠5只，在瘤体注射SB-3CT的基础上静脉注射多西他赛溶液10 mg/kg，每周1次，连续4周；空白对照组裸鼠5只，瘤体注射等量生理盐水。给药5周结束后，裸鼠用3.5%水合氯醛（10 mL/g）麻醉，脱颈处死，剥离肿瘤组织，称重，PBS缓冲液洗净，4%多聚甲醛固定。

1.3 免疫组化检测裸鼠移植瘤组织中PDK1和PFKFB4的表达

组织经脱水包埋，4 μm连续切片后，按照SP法进行免疫组化染色。采用免疫组化评分评估PDK1和PFKFB4的表达量。评分标准如下：阳性细胞比例0、1%～10%、11%～50%、51%～80%、81%～100%分别计为0分、1分、2分、3分、4分；再按染色强度无、弱、中、强分别计为0分、1分、2分、3分，最终评分为两个指标的乘积［13］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用最小显著差异法（LSD法），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠一般状况

3组实验动物皮下注射细胞悬液2周左右于皮下均可触及瘤体结节，成瘤率为100%。实验期间瘤块持续生长，多为圆形或椭圆形，大小较均匀。连续给药4周，各组裸鼠药物耐受性良好，未出现死亡情况。相对于空白对照组和SB-3CT组，联合用药组瘤块体积生长较缓慢。

2.2 SB-3CT对裸鼠移植瘤生长的影响

空白对照组平均瘤体质量为（1.34±0.05）g，SB-3CT组平均瘤体质量为（1.08±0.13）g，联合用药组平均瘤体质量为（0.88±0.08）g，3组平均瘤体质量差异有统计学意义（F=29.556，P=0.001），且联合用药组低于SB-3CT组（P=0.006）。与空白对照组和SB-3CT组相比，联合用药组肿瘤生长速度明显缓慢，见图1。

图1 裸鼠移植瘤的生长曲线Fig.1 Growth curves of nude mice xenograft

2.3 裸鼠移植瘤肿瘤组织中PDK1和PFKFB4的表达

显微镜下观察各组裸鼠离体肿瘤组织，可见细胞异型性明显，排列紊乱，核仁浓染，分裂相增多，符合恶性肿瘤组织特征。

PDK1在空白对照组肿瘤组织内染色呈片状，中等强度着色，阳性物质呈棕褐色或棕黄色，位于胞浆，组织间结缔组织可见强弱不等的非特异性染色；SB-3CT组和联合用药组染色阳性区域范围较空白对照组减少，染色强度偏弱，见图2。免疫组化结果显示，联合用药组、空白对照组和SB-3CT组的染色评分分别为（2.33±0.47）分、（6.00±0.81）分和（4.33±0.48）分，3组间比较差异有统计学意义（F=18.200，P=0.003），且联合用药组评分低于SB-3CT组（P=0.017）。

PFKFB4在空白对照组和联合用药组均明显表达，阳性物质主要定位于细胞质，空白对照组大部分区域呈强阳性表达，联合用药组表达总体呈中等强度染色，染色阳性比例低于空白对照组，见图2。免疫组化结果显示，联合用药组、空白对照组和SB-3CT组的染色评分分别为（5.33±0.49）分、（11.33±0.47）分和（9.00±1.41）分，3组间比较差异有统计学意义（F=17.643，P=0.003），且联合用药组评分低于SB-3CT组（P=0.011）。

图2 免疫组化检测PDK1和PFKFB4在裸鼠移植瘤组织中的表达（SP染色）Fig.2 Expression of PDK1 and PFKFB4 in nude mice xenografts detected by immunohistochemical staining（SP staining）

3 讨论

既往研究证实基质金属蛋白酶抑制剂可有效抑制MMP-9高表达的T细胞淋巴瘤肝转移［14］。SB-3CT在体内具有抑制明胶酶活性作用，通过降低肿瘤血管化和血管生成可抑制前列腺癌骨转移瘤［10］。前列腺癌组织普遍存在MMP-9高表达，且其表达程度与临床病理分期呈正相关，与肿瘤分化程度呈负相关［15-16］，提示MMP-9高表达可能在前列腺癌侵袭和进展中起关键作用，而以MMP-9为靶点的药物已用于临床治疗前列腺癌［17］。多西他赛化疗虽然是目前治疗去势抵抗性前列腺癌的一线方案，但单药治疗效果欠佳。一项来自欧洲的单中心研究显示［11］，多西他赛治疗去势抵抗性前列腺癌患者，经过平均1.6年的随访，94.1%的患者出现疾病进展并导致68.6%的患者死亡。本团队前期的体外细胞学实验结果证实：基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT可抑制前列腺癌PC-3细胞的存活，且10.0 μmol/L的SB-3CT浓度即可达到明显的抑制作用，28.8 μmol/L为半数抑制浓度，药物协同指数显示多西他赛与SB-3CT在体外具有较强的协同作用，与多西他赛单药相比，联合用药对体外培养的PC-3细胞存活具有更显著的抑制作用［12］。本研究构建前列腺癌裸鼠移植瘤模型，进一步证实联合应用多西他赛和SB-3CT可降低裸鼠移植瘤的质量，生长曲线显示SB-3CT单药和多西他赛联合用药均可降低裸鼠移植瘤生长速度，且与SB-3CT单药相比，联合用药具有更强的抑制作用，与前期体外细胞学实验结论一致。

肿瘤细胞具有独特的糖代谢特点，大多数恶性肿瘤细胞存在高代谢特征，特别是恶性肿瘤细胞的分裂增殖较正常细胞快，能量消耗相应增加，因此癌细胞的异常过度增殖常伴随葡萄糖过度消耗。近年来，随着氟代脱氧葡萄糖－正电子发射计算机断层显像（FDG-PET）的广泛临床应用，肿瘤细胞的糖代谢变化成为研究热点。“能量代谢异常”已被公认为肿瘤细胞的一个标志性特征［18-19］。PDK1和PFKFB4是细胞糖代谢途径中的关键酶，本团队前期采用shRNA沉默前列腺癌PC-3细胞中PDK1和PFKFB4基因的表达，发现PDK1和PFKFB4基因表达降低具有抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用；基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT可显著降低体外培养的PC-3细胞的葡萄糖消耗量，抑制细胞内PDK1和PFKFB4基因表达和提高细胞内活性氧（ROS）水平，这可能是SB-3CT发挥其作用的潜在分子机制［20］。本研究是前期细胞学实验基础上的进一步延续，剥离裸鼠移植瘤后，采用免疫组化检测各组裸鼠离体肿瘤组织中PDK1和PFKFB4的表达情况，结果显示联合用药亦可降低肿瘤组织内PDK1和PFKFB4的表达，与前期的体外细胞学实验结果一致，进一步验证了基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT联合多西他赛较SB-3CT单药可在体内进一步降低PDK1和PFKFB4的表达，继而可能通过降低肿瘤组织的糖代谢活性，从而发挥抑制前列腺癌移植瘤生长的作用。

本研究发现，多西他赛联合基质金属蛋白酶抑制剂SB-3CT对前列腺癌裸鼠移植瘤具有明显的抑制作用，且可能通过降低肿瘤组织中PDK1和PFKFB4的表达而影响糖代谢活性实现，多西他赛联合SB-3CT有望成为去势抵抗性前列腺癌治疗的新方案。