lncBRM对乳腺癌细胞生长的影响及作用机制

杨净渝 邱 爽 陈 昕

作者单位：650032昆明 云南省第一人民医院乳腺甲状腺外科

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在世界范围内发病率达24.2%［1-2］。乳腺癌的发生涉及多种癌基因（如原癌基因及抑癌基因）和多个阶段，是多种癌基因协同作用的结果，同时伴随着表观遗传学的改变，如组蛋白/DNA修饰变化、非编码RNA表达变化等［3-4］。然而其发病机制尚未完全阐明。多项研究发现长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作为调控因子参与细胞的生长、增殖、分化和凋亡等多种过程［5-7］，lncRNA表达失调与肿瘤发生发展关系密切［8-10］。Brahma是染色质重塑复合物SWI/SNF复合物的关键催化亚基，下调Brahma表达能抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移［11］。研究发现Brahma相关长链非编码RNA（long non-coding RNA for association with Brahma，lncBRM）与肝癌、卵巢癌及结肠癌等密切相关，且作为致癌基因参与肿瘤的发生发展［12-13］。然而其在乳腺癌发生发展中的作用尚未知。本研究通过检测lncBRM在不同乳腺癌细胞系中的表达，同时利用siRNA敲低lncBRM表达后分析lncBRM对乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-453增殖、迁移、侵袭和凋亡能力的影响，并在miRDB数据库预测并验证lncBRM对下游miRNA表达的调控作用，为阐明乳腺癌发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

正常人乳腺上皮细胞株MCF 10A以及乳腺癌细胞系 MCF-7、ZR-75-30、BT474、MDA-MB-231 和 MDAMB-453均购自中科院上海细胞库；DMEM培养基购自美国HyClone公司；胎牛血清和0.05%胰酶/EDTA购自美国Gibco公司；空载质粒和lncBRM敲低质粒（si-lncBRM）购自上海吉玛公司；Transwell小室购自美国BD公司；E-cadherin、N-cadherin和GAPDH抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.2 细胞培养与转染

细胞均置于37℃、5%CO2，含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。1 mL胰蛋白酶于37℃条件下消化5 min，然后加2 mL含血清培养基终止反应，按1∶4比例进行传代。选择对数期生长的细胞（MCF-7、MDA-MB-453细胞），按每孔60 000个细胞的密度铺于6孔板，用无抗生素培养基培养，待细胞生长约50%覆盖率时转染。在100 μL培养基中添加质粒DNA样品（1 μg），混匀并静置 5 min；同时在 100 μL 培养基中添加转染试剂（3 μL），混匀并静置5 min；随后两者混合并放置20 min。转染si-lncBRM质粒的乳腺癌细胞定义为si-lncBRM组，转染空载质粒的乳腺癌细胞定义为si-Ctrl组。相关操作严格按照LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂盒说明书进行。转染48 h后，弃培养基，收集细胞进行后续检测。

1.3 RT-PCR实验检测lncBRM mRNA的表达量

按照TRIzol（Life technology）说明书分别提取各细胞系不同处理条件下的RNA。取2 μg RNA按照说明书利用M-MLV反转录酶体系（Promega）把总RNA反转录成cDNA，进行RT-PCR。PCR反应体系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Mix，1 μL 10 μmol/L 引物，5 μL cDNA模板，用ddH2O补齐体积到20 μL。反应条件：⑴94℃预变性3 min；⑵94℃变性15 s；⑶60℃退火20 s；⑷72℃延伸20 s；⑸步骤⑵～⑷循环40次；⑹72℃延伸5 min。以GAPDH作为内参。lncBRM上游引物为5'-GGTCAAGAGGCCAGGAAGAG-3'，下游引物为 5'-TTCTCACTTCAGCCCAATGCT-3'；GAPDH 上游引物为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下 游 引 物 为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；采用 2-ΔΔCt法计算lncBRM mRNA的表达量。

1.4 CCK-8法测定细胞增殖能力

取对数期生长的MCF-7和MDA-MB-453细胞消化后接种至96孔板（3×103/孔），分别转染空载质粒和si-lncBRM质粒，培养24 h、48 h和72 h时，每孔分别加入10 μL CCK-8试剂，培养2 h。利用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度（OD）值，参考波长为655 nm，即代表细胞的增殖能力。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况

细胞转染siRNA 48 h，胰酶消化后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次，计数细胞，根据PI/Annexin V试剂盒说明书取10 000个细胞染色（避光）30 min。利用流式细胞仪LSRII进行定量分析。

1.6 Transwell小室实验检测细胞侵袭和迁移能力

将转染24 h后各组细胞制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬液。用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部，4℃风干。吸出残余液体后添加50 μL含10 g/L牛血清白蛋白的无血清培养液，37℃孵育0.5 h，用于检测细胞的侵袭能力。检测细胞迁移能力时不添加Matrigel胶。然后在Transwell小室上室内加入含1%胎牛血清DMEM培养基的各组细胞悬液200 μL，下室加入500 μL含有10% 胎牛血清的完全培养基，置于孵箱中培养。24 h后，棉签擦去上层细胞，纯甲醇固定滤膜20 min，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下拍照，并对穿膜细胞数进行统计。

1.7 Westernblot检测E-cadherin和N-cadherin表达量

根据细胞数加入相应量的RIPA裂解液，提取蛋白质，Bradford assay测定蛋白浓度。取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE，湿转至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭1 h，加入5 mL配制好的兔E-cadherin单克隆一抗（1∶20 000）、兔 N-cadherin 单克隆一抗（1∶50 000）和兔 GAPDH 单克隆一抗（1∶10 000），4℃孵育过夜；第2天加入5 mL HRP耦联的羊抗兔IgG二抗（1∶50 000），室温孵育1 h，用ECL发光液曝光显影，ImageLab 4.0软件进行灰度分析。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，事后检测采用Tukey检验；两组间均数比较采用独立样本t检验。以双侧P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 lncBRM在不同乳腺癌细胞中的表达水平

RT-PCR检测结果显示，lncBRM在5株乳腺癌细胞中的表达水平均高于在正常人乳腺上皮细胞株MCF 10A的表达水平（均P＜0.01），且在MDA-MB-453细胞中表达最高，其次为MCF-7细胞，见图1。

图1 lncBRM在不同乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞中的表达Fig.1 Expression of lncBRM in different breast cancer cell lines and normal breast epithelial cells

2.2 敲低lncBRM抑制乳腺癌细胞增殖能力

RT-PCR结果显示，与si-Ctrl组比较，si-lncBRM组MCF-7和MDA-MB-453细胞中的lncBRM表达水平降低，降低约80%（均P＜0.001），见图 2A～B；CCK-8法测定结果显示，转染48 h、72 h和96 h后，si-lncBRM组MCF-7和MDA-MB-453细胞增殖能力均较si-Ctrl组降低（均 P＜0.05），见图 2C～D。

图2 lncBRM敲低可降低乳腺癌细胞的增殖能力Fig.2 lncBRM knockdown reduced the proliferation of breast cancer cells

2.3 敲低lncBRM可促进乳腺癌细胞凋亡

采用PI/Annexin V流式细胞术检测lncBRM对乳腺癌细胞凋亡的影响，结果显示，与si-Ctrl组相比，si-lncBRM组MCF-7和MDA-MB-453细胞凋亡率明显增加，分别增加2.57倍和3.04倍（均P＜0.01）。见图3。

图3 lncBRM敲低可促进乳腺癌细胞的凋亡Fig.3 lncBRM knockdown promoted the apoptosis of breast cancer cells

2.4 敲低lncBRM抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移

Transwell小室实验结果显示，与si-Ctrl组相比，si-lncBRM组MCF-7和MDA-MB-453细胞的侵袭细胞数目减少（均 P＜0.001），见图 4A～B；MCF-7 和 MDAMB-453细胞的迁移细胞数目亦降低（均P＜0.001）。见图4C～D。Western blotting检测结果显示，与si-Ctrl组相比，si-lncBRM组E-cadherin蛋白水平明显上调，而N-cadherin蛋白表达下降（均P＜0.001）。见图5。

图4 lncBRM敲低抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移Fig.4 lncBRM knockdown inhibited the invasion and migration of breast cancer cells

图5 lncBRM敲低后E-cadherin和N-cadherin的表达Fig.5 Expression of E-cadherin and N-cadherin after knocking down lncBRM expression

2.5 lncBRM和miRNA存在结合位点并调控其表达

本研究利用miRDB数据库对lncBRM下游靶点进行预测发现，lncBRM和68个miRNA存在结合位点，其中评分＞80分的有16个，排名前5位的miRNA分别为 miR-4646-5p、miR-204-3p、miR-211-5p、miR-204-5p和miR-6832-3p。见图6A。利用RT-PCR检测上述miRNA在MCF-7细胞中的表达。结果显示，与si-Ctrl组相比，敲低lncBRM后可提高miR-4646-5p、miR-204-3p、miR-204-5p和 miR-6832-3p的表达（均P＜0.01），但 miR-211-5p表达未见明显变化（P＞0.05）。见图6B。

3 讨论

lncBRM是一种定位于5号染色体的非编码RNA，ZHU等［13］发现lncBRM在肝癌中高表达且能够通过激活YAP信号通路而促进肝癌干细胞的自我更新。lncBRM也可促进卵巢癌细胞增殖和迁移［12］。然而lncBRM在乳腺癌中的表达和调控作用仍未知。本研究探讨lncBRM对乳腺癌细胞增殖、凋亡及转移的影响，并预测lncBRM对下游miRNA的调控，结果发现lncBRM在乳腺癌细胞中的表达水平高于正常乳腺上皮细胞，与ZHU等［13］研究结果相近，即lncBRM在肿瘤细胞中高表达，提示lncBRM可能在乳腺癌中发挥促癌的作用。随后本研究选取表达量较高的2种乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-453进一步观察lncBRM的调控作用。体外实验结果表明，敲低lncBRM可抑制MCF-7和MDA-MB-453细胞增殖，同时提高了MCF-7和MDA-MB-453细胞的凋亡率，亦与ZHU等［13］在肝癌中的研究结果一致。说明lncBRM在乳腺癌中可能发挥致癌作用。

图6 lncBRM调控miRNA表达Fig.6 lncBRM regulated miRNA expression

癌细胞发生转移是乳腺癌患者死亡的主要原因［14］。研究发现lncRNA在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤转移中发挥调控作用［12-16］。本研究采用Transwell小室实验观察lncBRM在乳腺癌转移中的调控作用，发现敲低lncBRM表达可抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-453细胞侵袭以及迁移能力，表明lncBRM对乳腺癌转移具有促进作用。进一步检测转移相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达情况，发现敲低lncBRM表达抑制了MCF-7和MDA-MB-453细胞E-cadherin的表达，同时明显促进了N-cadherin表达，与XI等［12］在卵巢癌中的研究结果一致，进一步证实了lncBRM对乳腺癌细胞转移具有促进作用。

lncRNA作为分子海绵靶向吸附miRNA的作用机制备受关注［17］。研究报道lncBRM对肺癌细胞中miR-211-5p、卵巢癌细胞中miR-204-3p具有靶向调控作用［16］。本研究利用miRDB数据在乳腺癌细胞中预测并验证lncBRM对下游miRNA表达的调控作用，发现lncBRM和68个miRNA存在结合位点，其中16个miRNAs评分＞80分。检测评分最高的前5个miRNAs的表达，发现敲低lncBRM后，MCF-7细胞中miR-4 646-5p、miR-204-3p、miR-204-5p 和 miR-6832-3p的表达升高，但miR-211-5p表达未见明显变化。FAN等［18］报道miR-204在乳腺癌中低表达，且上调miR-204-5p能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。CHEN等［19］发现miR-211-5p在三阴性乳腺癌中低表达，且可抑制细胞增殖和转移，而miR-4646-5p在结直肠癌中低表达［20］。上述结果表明lncBRM可能通过调控miRNA表达而在乳腺癌中发挥致癌作用。

综上所述，本研究发现lncBRM能促进乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，同时抑制乳腺癌细胞凋亡，且lncBRM可能通过调控miRNA表达而发挥作用，这一结果为阐明乳腺癌发病机制提供了新思路，lncBRM有望成为乳腺癌诊断、预后评估及治疗的新靶点。但是lncBRM具体通过何种miRNA调控肿瘤发展及促进乳腺癌转移有待后续进一步深入研究。