NKX6.3对食管癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响及作用机制

郑银彬 吴国俊 罗 晖 汪 华 杜宗汉

作者单位：637000 南充 南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院1胸心外科，2消化内科

食管癌是发生于食管上皮组织的恶性肿瘤，在我国发生率约占所有恶性肿瘤的3.2%［1］。目前临床上超过90%的食管癌患者确诊时已进展至中晚期，传统的治疗手段如手术、放化疗等综合治疗手段不断进步，但患者预后仍较差，5年生存率低于20%［2］。近年来分子靶向治疗取得一定成效，而探索有效的治疗靶点成为研究的热点之一。NKX6.3是NKX6家族蛋白一类进化上保守的转录因子，位于人体染色体4q21.2-q22上，其编码的蛋白是细胞受应激原刺激后诱导产生的一种应激蛋白，与肿瘤发生、增殖及分化有关［3］。在胃癌细胞研究中发现，NKX6.3基因可抑制细胞周期进程并通过死亡受体和线粒体途径诱导细胞凋亡，从而明显阻止细胞增殖［4］。而NKX6.3在食管癌细胞中是否也发挥同样作用尚未知。本研究在食管癌EC9706细胞中转染NKX6.3后观察其对细胞增殖、凋亡及侵袭的影响以及对活性氧的调节作用，并探讨其作用机制，以期为食管癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

食管癌EC9706细胞购自中国科学院细胞库；TRAIL 购自英国 Pepro Tech 公司；Caspase-3、Bcl-2、Bax抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；E-cadherin、N-cadherin、NKX6.3抗体购自Santa Cruze Biotechnology公司；Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司；CCK-8试剂盒购自默沙克有限公司；Lip2000 Transfection Reagent转染试剂盒购自金克隆（北京）生物技术有限公司。酶联免疫检测仪购自北京诺亚威仪器仪表有限公司；荧光分光光度计购自上海仪电分析仪器有限公司；全自动生化分析仪购自日本日立公司；流式细胞仪购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 细胞培养和转染

食管癌EC9706细胞培养于含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素RPMI 1640培养基的37℃、5%CO2培养箱，细胞汇合率达85%以上进行传代培养。根据LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒说明书转染细胞。食管癌EC9706细胞传三代培养于6孔板中，24 h后分别转染NKX6.3（NKX6.3组）和空白质粒（miR-NC组），并设空白对照组（Control组）。载体为pcDNA3.1-3xflag，严格按照转染试剂盒说明书方法操作。用不含抗生素的培养基接种细胞，接种量（0.5～2.0）×105个，24 h 后待细胞生长至 80%左右汇合，按照说明书配置方法制成DNA和Lip2000稀释液，将DNA-Lip2000复合物加入接种细胞，培养48 h后收集并筛选细胞，进行Western blot检测。

1.3 RT-PCR检测食管癌EC9706细胞NKX6.3的表达

转染后收集各组细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度后用反转录试剂盒合成cDNA，进行PCR反应。PCR引物序列：NKX6.3的上游引物 5′-GCGAATTCATGGACGTTAATATCGCCC-3′，下游引物 5′-CGTCTAGATTCCTTCACTTGCTGATATAG-3′；以 β-actin 为参照，上游引物 5′-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3′，下游引物 5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3′。PCR 反应条件：95 ℃、15 min；95 ℃ 15s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1s，共 40 个循环，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。实验重复3次。

1.4 CCK-8法检测食管癌EC9706细胞增殖情况

取各组对数生长期细胞，接种于96个孔板中（100 μL／孔），于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h。分别于培养 0 h、12 h、24 h、48 h 后加入 10 μL CCK-8溶液并培养2 h，用酶标仪测定450 nm处各孔吸光度（OD）值，计算细胞增长率。细胞增长率（%）=［（对照组OD值-实验组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）］×100%。实验重复3次。

1.5 流式细胞仪检测食管癌EC9706细胞凋亡、活性氧及线粒体膜电位情况

收集各组待测EC9706细胞，加入100 μL Binding Buffer重悬，然后加入5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI，室温避光孵育 15 min后加入 400 μL Binding Buffer，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

将2×105个对数生长期的EC9706细胞接种于6孔培养板，细胞生长至90%融合时加入DDP培养2 h，胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，过滤后加入终浓度为5 μmol/L的 DCFH-DA，37 ℃孵育 30 min，于激发波长488 nm、发射波长530 nm处用流式细胞仪检测细胞荧光强度。检测细胞内线粒体荧光强度时细胞生长至90%融合时加入DDP后培养12 h，胰蛋白酶消化后加入100 μmol/L的荧光染料DiOC6（3），其余步骤同上。

1.6 Transwell法检测食管癌EC9706细胞侵袭能力

取对数生长期的EC9706细胞，调节细胞密度为1×105/mL，将 Transwell小室放入 24 孔板，4°C 预冷，上室加入1∶4稀释的Matrigel基质胶，待凝固后上室加入RPMI1640培养基400 μL，下室加入正常培养液。细胞沉降后培养24 h，用无菌棉签擦去小室内细胞，用结晶紫对侵袭至小室下层的细胞进行染色，拍照、计数穿膜细胞，每组3个复孔，实验至少重复3次。

1.7 Western blot检测食管癌EC9706细胞蛋白表达水平

收集对数生长期的EC9706细胞，用含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解，提取蛋白并取15～20 μL，电泳、转膜、封闭，室温下静置 30～60 min。一抗（稀释比例1∶1 000）4°C孵育过夜，二抗（稀释比例1∶3 000）室温孵育l h。显色，然后用凝胶成像系统曝光，以Actin为内参蛋白，相对蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析，计量数据组间比较采用单因素方差分析，若组间差异有统计学意义，采用SNK法进一步行多重比较。以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌EC9706细胞中NKX6.3的表达

Western blot和RT-PCR检测显示，转染后Control组、miR-NC组、NKX6.3组NKX6.3蛋白表达差异有统计学意义（F=8.987，P=0.001），NKX6.3 mRNA 表达差异亦有统计学意义（F=12.396，P＜0.001），其中NKX6.3组蛋白和mRNA表达量均高于miR-NC组（均P＜0.01）。见图 1。

2.2 NKX6.3对食管癌EC9706细胞增殖的影响

Western blot实验显示，Control组、miR-NC 组、NKX6.3组Ki67蛋白表达组间差异有统计学意义（F=7.018，P=0.001），CCK-8 法检测亦显示 3 组细胞增殖率差异有统计学意义（F=6.378，P=0.003），其中NKX6.3组Ki67蛋白表达量和细胞增殖率均低于miR-NC 组（均 P＜0.01）。见图 2。

图1 转染后食管癌EC9706细胞中NKX6.3的表达情况Fig.1 Expression of NKX6.3 in esophageal cancer EC9706 cells after transfection

图2 NKX6.3对食管癌EC9706细胞增殖的影响Fig.2 Effect of NKX6.3 on the proliferation of esophageal cancer EC9706 cells

2.3 NKX6.3对食管癌EC9706细胞内活性氧、线粒体膜电位的影响

流式细胞仪检测活性氧、线粒体膜电位，结果显示，Control组、miR-NC 组、NKX6.3组细胞活性氧、线粒体膜电位组间差异有统计学意义（F=22.369，P＜0.001），其中NKX6.3组细胞活性氧高于miR-NC组，而线粒体膜电位低于miR-NC组（P＜0.001）。见图3。

图3 NKX6.3对食管癌EC9706细胞活性氧和线粒体膜电位的影响Fig.3 Effects of NKX6.3 on reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential of esophageal cancer EC9706 cells

2.4 NKX6.3对食管癌EC9706细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测检细胞凋亡情况，结果显示，Control组、miR-NC组、NKX6.3组细胞凋亡率差异有统计学意义（F=18.076，P＜0.001），其中 NKX6.3 组细胞凋亡率高于miR-NC组（P＜0.001）。见图4A。Western blot检测结果显示，3组细胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达水平差异亦有统计学意义（F=22.369，P＜0.001），其中NKX6.3组Bcl-2蛋白表达水平较miR-NC组降低（P＜0.001），而Bax及Caspase-3蛋白表达水平升高（P＜0.001）。见图 4B。

图4 NKX6.3对食管癌EC9706细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of NKX6.3 on apoptosis of esophageal cancer EC9706 cells

2.5 NKX6.3对食管癌EC9706细胞侵袭的影响

Transwell小室实验结果显示，Control组、miR-NC组、NKX6.3组细胞侵袭数目差异有统计学意义（F=10.972，P＜0.001），其中NKX6.3组细胞侵袭数目较miR-NC组降低（P＜0.001）。见图5A。Western blot检测结果显示，3 组细胞 Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表达水平差异亦有统计学意义（F=16.789，P＜0.001），其中与miR-NC组相比，NKX6.3组N-cadherin蛋白表达水平降低（P＜0.001），而 Vimentin、E-cadherin 蛋白表达水平升高（P＜0.001）。见图 5B。

图5 NKX6.3对食管癌EC9706细胞侵袭的影响Fig.5 Effect of NKX6.3 on the invasion of esophageal cancer EC9706 cells

3 讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，也是临床上绝大多数肿瘤患者的致死因素，因此阻止肿瘤表达的转移相关因子可能有助于抑制恶性肿瘤的发生与转移。目前研究发现NKX6.3可调控癌细胞的生物学特性。Ki67是细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，在维持DNA结构稳定及细胞有丝分裂过程中发挥重要作用，也是反映细胞增殖的敏感指标［5-6］。本研究构建过表达NKX6.3的食管癌细胞后，Western blot检测发现转染NKX6.3后Ki67蛋白降低，细胞增殖亦明显受抑制，说明NKX6.3可抑制食管癌细胞增殖，而这可能通过抑制Ki67表达而阻碍食管癌细胞有丝分裂过程实现。

线粒体是调控细胞凋亡的核心，当线粒体通透性改变其膜电位也会随之改变［7］。刘亮等［8］通过降低食管癌EC9706细胞线粒体膜电位，启动内源性线粒体凋亡途径，从而促进细胞凋亡。除了线粒体膜电位，细胞内的活性氧水平也是细胞凋亡的关键因素之一，可作用于线粒体而促使线粒体膜通透性改变、膜电位下降、释放色素C等［9］。本研究中的流式细胞仪检测结果显示，转染NKX6.3后细胞凋亡水平明显增强，细胞活性氧水平升高，而线粒体膜电位降低，说明NKX6.3可促进细胞凋亡。而除了线粒体凋亡途径，基因也是调控细胞凋亡的主要途径之一。Caspase是一种具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是一组在细胞凋亡过程中起着关键作用的酶，其中Caspase-9基因处于Caspase家族激活基因的顶端，是Caspase家族中最常见的凋亡启动子，通过自身裂解可使pro-Caspase-3产生有活性的Caspase-3，然后通过剪切另外的Caspase底物引起级联反应，最终导致细胞凋亡［10］。Bcl-2家族也是常见的凋亡控制基因，当Bcl-2表达下降，Bax表达上升时，可促进细胞凋亡；而当Bcl-2表达升高，Bax表达降低时，则抑制细胞凋亡［11-12］。本研究进一步检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）的表达情况，发现转染NKX6.3后细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低，而Bax及Caspase-3蛋白表达水平升高，由此可见，NKX6.3基因既可通过提高癌细胞的氧化应激反应而促进细胞凋亡，也可以通过影响凋亡相关基因表达而抑制细胞凋亡。

上皮间质转化（epithelial mesenchyml transition，EMT）使肿瘤侵袭和转移的早期事件，肿瘤细胞可通过细胞极性丧失，改变自身细胞形态而与其他细胞分离［13-14］。EMT过程通常伴随着相关蛋白的表达变化，例如E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等。其中E-cadherin和N-Cadherin是钙依赖性的跨膜蛋白，参与细胞与细胞间黏附，其含量改变会影响细胞间的黏附作用，当N-cadherin蛋白含量降低、E-cadherin蛋白含量升高时，细胞间的黏附能力增强，可抑制癌细胞侵袭和迁移［15-16］。本研究发现，转染NKX6.3后细胞侵袭和迁移能力减弱，N-cadherin蛋白表达水平降低，而Vimentin、E-cadherin蛋白表达水平升高，说明过表达NKX6.3可能通过抑制EMT过程，增强细胞间的黏附能力，从而降低食管癌细胞的侵袭及迁移能力，抑制肿瘤扩散和转移。

本研究发现，NKX6.3可通过提高食管癌细胞中的活性氧成分，破坏其线粒体膜结构，降低膜电位，以及调控凋亡相关基因表达而促进细胞凋亡，通过抑制增殖相关蛋白表达及EMT过程而降低细胞增殖和侵袭能力，因此NKX6.3可能是阻断食管癌转移和治疗的潜在靶点。但NKX6.3对食管癌细胞的具体作用机制以及在其他食管癌细胞系及动物体内中的作用有待进一步研究。